整合素ανβ3在大鼠青光眼滤过术后结膜瘢痕形成中的作用
2021-04-12朱晓燕谢琳谭薇
朱晓燕 谢琳 谭薇
1遵义医科大学第三附属医院 遵义市第一人民医院眼科 563002;2陆军军医大学大坪医院眼科,重庆 400042
朱晓燕现在贵州省人民医院眼科,贵阳 550002;谢琳现在重庆医科大学附属第三医院眼科 401120
抗青光眼手术是青光眼降眼压的主要治疗方式之一,而滤过通道结膜瘢痕形成是手术失败的主要原因,失败率为15%~30%[1]。因此,通过抑制瘢痕化提高抗青光眼手术的成功率仍是眼科研究的重要方向之一。临床上广泛应用丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶减轻青光眼术后瘢痕化,提高滤过术的成功率,但仍然存在较多的并发症,如愈合延迟、术后浅前房、滤过泡渗漏及角膜毒性等,严重影响手术效果[2-3]。临床上尚缺乏有效的、毒性作用和不良反应小的药物以减少瘢痕形成,延长滤过泡生存时间。因此如何预防和减少术后结膜瘢痕形成仍然是青光眼手术治疗的一大难题,也是研究的重点之一。整合素属于一类跨膜蛋白,由2个亚基通过非共价键组成异源二聚体,是细胞表面重要的黏附分子和介导细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相互作用的重要分子之一,在创伤愈合、癌细胞的转移以及纤维化相关疾病中发挥重要作用[4-5]。整合素ανβ3亚型是分布较广泛的ECM受体,包括1个相对分子质量为125 000的αν亚基和1个相对分子质量为105 000的β3亚基,在创面愈合的重塑期发挥重要作用,可以结合并激活多种细胞因子,参与细胞增生、迁移及分化[5]。研究发现,在硬皮病来源的成纤维细胞中,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的促纤维化作用是通过整合素ανβ3介导的[6-7],整合素ανβ3可与TGF-β Ⅱ型受体结合参与促成纤维细胞增生作用[8]。研究已证实TGF-β可显著促进青光眼滤过术后结膜组织瘢痕形成[9-11],然而目前关于TGF-β与整合素ανβ3之间的相互作用关系尚不明确,各研究报道结论有很大差异。整合素ανβ3在眼结膜组织瘢痕形成中的作用尚不清楚。本研究拟观察整合素ανβ3在青光眼大鼠手术模型中手术区结膜组织的表达变化,并探讨其在滤过术后瘢痕形成中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物及分组 选取SPF级6~8周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠55只(陆军军医大学动物中心提供),体质量250~350 g,均在12 h明暗循环、室温22~25 ℃、相对湿度为(50±5)%的环境中饲养。排除因发生晶状体损伤、前房出血或微管脱落、移位手术失败的大鼠15只,采用随机单位组设计分组法将造模成功大鼠分为对照组、TGF组、LM609组和TGF+LM609组,每组10只。实验遵循《陆军军医大学实验动物管理条例》,遵从《善待实验动物指导性意见》的相关伦理学规定,经陆军军医大学大坪医院伦理委员会审核批准[批文号:医研伦审(2017)第06号]。
1.1.2主要试剂及仪器 质量分数0.4%盐酸奥布卡因滴眼液、左氧氟沙星滴眼液(日本参天制药有限公司);质量分数0.25%氯霉素滴眼液(安徽环球药业股份有限公司);质量分数10%水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司];黏弹剂(美国博士伦公司);直接红80、固绿FCF、苦味酸(美国Sigma公司);人重组TGF-β2(美国Pepro Tech公司);ECL发光液、整合素ανβ3受体阻断剂LM609(美国Millipore公司);组织固定液(深圳欣博盛生物科技有限公司);兔抗整合素αν单克隆抗体(ab179475)、兔抗整合素β3单克隆抗体(ab119992)、小鼠抗整合素ανβ3单克隆抗体(ab7166)(美国Abcam公司);羊抗兔HRP标记二抗、山羊抗鼠HRP标记二抗、苏木精-伊红染色试剂盒、细胞裂解液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。静脉穿刺微管系统(美国Fine Science Tools公司);显微镜、石蜡组织切片机、倒置荧光显微镜(德国Leica公司);数码照相系统(美国SPOT公司);超低温冰箱(日本Sanyo公司);台式低温高速离心机(德国Heraeus公司);扫描分析软件系统(美国Labworks Analysis Software公司);手术显微镜(苏州六六视觉科技股份有限公司);Tonolab眼压计(芬兰Icare公司);眼科手术显微器械(苏州医疗器械有限公司)。
1.2 方法
1.2.1大鼠滤过性手术模型的建立 以大鼠右眼为手术眼,术前使用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液点术眼3次,10%水合氯醛腹腔内注射麻醉(0.3 ml/100 g)大鼠,质量分数0.5%碘伏溶液常规消毒术眼周围,0.25%氯霉素滴眼液冲洗结膜囊3次,以穹隆部为基底制作约2 mm×2 mm结膜瓣,对照组、TGF组、LM609组、TGF+LM609组分别采用质量分数0.9%氯化钠溶液棉片、TGF-β2(2 mg/ml)溶液棉片、LM609(40 μg/ml)溶液棉片、TGF-β2(2 mg/ml)+LM609(40 μg/ml)溶液棉片处理结膜瓣2 min;0.9%氯化钠溶液冲洗,30G针头穿刺前房,注入少量黏弹剂维持前房,将2 mm微管植入前房,末端埋于结膜瓣下,角膜缘固定微管1针,10-0缝线缝合结膜瓣,术后予以左氧氟沙星滴眼液点术眼。
1.2.2眼压监测及滤过泡形态观察 每组选取8只大鼠,分别于术前及术后3 d、1周、2周采用iCARE眼压计测量眼压,测量6次取平均值,正常大鼠眼压测量值的稳定性较差,因此采用同一只大鼠术前与术后的测量值比率进行比较,术后平均眼压比率=术后眼压/术前眼压×100%;术后3 d、1周、2周采用裂隙灯显微镜检查手术区结膜及角膜组织的充血水肿情况、滤过泡形态和前房情况等,通过眼前节拍照记录结膜滤过泡形态变化,由同一医师标记滤过泡区域3次,采用ImageJ(1.8.0)软件计算滤过泡平均面积,分别计算出每组术后3 d及术后2周滤过泡面积,滤过泡生存比率=术后2周滤过泡面积/术后3 d滤过泡面积×100%。
1.2.3苏木精-伊红染色、苦味酸-天狼星红染色法观察手术区组织炎性改变及纤维化程度 每组选取3只大鼠,术后2周腹腔内注射10%水合氯醛麻醉大鼠,采用颈椎脱臼法处死大鼠,摘取大鼠眼球,置于组织固定液(质量分数4%多聚甲醛+乙酸+冰醋酸)中固定24 h。平行视轴切去眼球的1/3,注意保护手术区域,继续固定12 h,置于体积分数55%乙醇中过夜,梯度乙醇(60%、70%、80%、90%、100%)脱水,二甲苯透明5 min,浸蜡1 h,石蜡包埋,连续5 μm厚石蜡切片,37 ℃烤片过夜。取石蜡切片按照试剂盒说明书进行苏木精-伊红染色,观察各组手术区球结膜组织的炎症反应;另取石蜡切片,质量分数0.1%直接红80、0.1%固绿FCF和1.2%苦味酸混合液中37 ℃避光孵育1 h,去离子水冲洗切片1~2遍,吹干玻片,倒置显微镜下观察并拍照记录,Ⅰ型胶原呈黄色或红色,Ⅲ型胶原呈绿色,观察手术区球结膜组织纤维化程度及胶原纤维沉积情况。
1.2.4Western blot法检测手术区结膜组织整合素αν、β3的相对表达量 每组选取3只大鼠,同1.2.3方法摘取大鼠眼球,剪取滤过手术区的结膜组织,加入组织细胞裂解液,将组织研磨碎,移入EP管中,离心半径13.5 cm,4 ℃条件下1 000 r/min离心10 min,将上清液移入新的EP管中,测定蛋白浓度,调整样品蛋白浓度一致,加入上样缓冲液,煮沸10 min。各样本取相同的蛋白量20 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将蛋白转印到PVDF膜,质量分数5%脱脂牛奶室温封闭2 h,兔抗整合素αν一抗(1∶ 5 000)、兔抗整合素β3一抗(1∶ 1 000)4 ℃孵育过夜,洗膜后羊抗兔HRP标记二抗(1∶ 1 000)室温孵育1 h,ECL发光试剂曝光检测结果。每个样本重复检测3次,采用凝胶图像分析系统对蛋白条带进行灰度值转换,以β-actin为内参,计算各目的蛋白的相对表达量。
1.2.5免疫组织化学染色法检测整合素ανβ3定位表达情况 将组织石蜡切片置于60 ℃烤箱中烤片2 h,梯度脱蜡,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)浸洗3次,5 min/次,0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)微波加热至沸腾,抗原修复30 min;自然冷却后PBS浸洗3次,5 min/次,体积分数3% H2O2溶液室温孵育10 min,PBS浸洗3次,5 min/次,体积分数10%山羊血清溶液室温封闭30 min;滴加小鼠抗整合素ανβ3一抗(1∶ 200),4 ℃孵育过夜;PBS浸洗3次,5 min/次,滴加山羊抗鼠HRP标记二抗(1∶ 100),室温孵育30 min,PBS浸洗3次,5 min/次;滴加适当比例的HRP标记链霉卵白素,室温孵育30 min,PBS浸洗3次,滴加DAB显色液显色15 s~3 min,显微镜下观察组织呈褐色,立即放入水中终止,苏木素染液进行核复染2~3 min,用水冲洗3~7 min,返蓝后快速盐酸乙醇分化数秒,自来水冲洗5 min,将切片吹干后,中性树脂封片,倒置显微镜下观察并拍照记录。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。检测指标数据经Shapira-Wilk检验符合正态分布,以mean±SD表示,经Levene检验方差齐。采用完全随机分组实验设计,组间总体比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠滤过术后平均眼压比率比较
各组大鼠术后第3天眼压均较术前明显降低,术后1~2周逐渐恢复至术前水平。术后2周,对照组、TGF组、LM609组和TGF+LM609组平均眼压比率分别为(101.80±4.44)%、(103.90±5.65)%、(94.10±7.45)%和(100.60±4.61)%,总体比较差异有统计学意义(F=4.571,P=0.010),其中TGF组和TGF+LM609组平均眼压比率均大于对照组,TGF组平均眼压比率大于TGF+LM609组,差异均无统计学意义(均P>0.05);LM609组平均眼压比率均小于对照组、TGF组和TGF+LM609组,差异均有统计学意义(均P<0.05)(图1)。
图1 大鼠滤过术后2周各组平均眼压比率比较 F=4.571,P=0.010.与对照组比较,aP<0.05;与TGF组比较,bP<0.05;与LM609组比较,cP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验,n=8) TGF:转化生长因子;LM609:整合素ανβ3受体阻断剂Figure 1 Comparison of the mean intraocular pressure ratio among various groups at 2 weeks after filtering surgery F=4.571,P=0.010.Compared with the control group,aP<0.05;compared with the TGF group,bP<0.05;compared with the LM609 group,cP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=8) TGF:transforming growth factor;LM609:integrin ανβ3 receptor antagonist
2.2 各组大鼠滤过术后结膜滤泡形态改变及滤过泡生存比率比较
滤过术后第3天,各组均可观察到隆起的、微白的滤过泡。术后第2周,对照组和TGF+LM609组滤过泡变为扁平状,球结膜组织稍有增厚且有新生血管长入,球结膜下可见包裹的微管末端;TGF组球结膜组织明显增厚,并有大量血管长入;LM609组滤过泡形态较术后3 d明显局限,球结膜组织未见明显增厚,且LM609组结膜组织血管化较其他各组明显减少(图2)。对照组、TGF组、LM609组和TGF+LM609组滤过泡生存比率分别为(17.24±4.51)%、(8.80±2.35)%、(31.04±6.83)%和(15.86±4.67)%,总体比较差异有统计学意义(F=37.720,P<0.05),其中TGF组滤过泡生存比率明显低于对照组、LM609组和TGF+LM609组,LM609组滤过泡生存比率明显高于对照组和TGF+LM609组,差异均有统计学意义(均P<0.05),对照组与TGF+LM609组滤过泡生存比率比较差异无统计学意义(P=0.860)。
图2 各组大鼠滤过术后3 d、2周结膜滤过泡形态 滤过术后3 d,各组均可观察到隆起的、微白的囊泡样滤过泡。术后2周,对照组和TGF+LM609组滤过泡变为扁平状,球结膜组织稍有增厚且有新生血管长入,球结膜下可见包裹的微管末端;TGF组球结膜组织明显增厚充血,并有大量的血管长入其中;LM609组滤过泡形态较术后3 d明显局限 TGF:转化生长因子;LM609:整合素ανβ3受体阻断剂Figure 2 Morphology of conjunctival filtering blebs in various groups at 3 days and 2 weeks after filtering surgery On the third day after surgery,the raised and tinted white filtering blebs were found in each group.Two weeks after operation,the filtering blebs became flat,and the bulbar conjunctiva tissue was thickened with neovascularization,and wrapped end of the microtubule could be seen under the bulbar conjunctiva in the control group and TGF+LM609 group;the conjunctival tissue in the TGF group was obviously thickened and congested with neovascularization;more significantly localized filtering bleb than that on the third day after operation was found in the LM609 group TGF:transforming growth factor;LM609:integrin ανβ3 receptor antagonist
2.3 各组大鼠滤过术后2周滤过泡通道结膜组织的胶原沉积情况
对照组可见球结膜组织增厚,球结膜可见少许红色胶原纤维沉积;TGF组可见结膜组织仍有明显的炎症反应,中性粒细胞、单核巨噬细胞浸润,大量成纤维细胞增生,球结膜下全层均可见致密的红色胶原纤维沉积。LM609组及TGF+LM609组炎性细胞均较TGF组减少,可见部分成纤维细胞增生,球结膜下可见较疏松的红色Ⅰ型胶原纤维及部分呈绿色的Ⅲ型胶原纤维(图3)。
图3 各组大鼠滤过术后2周手术区组织炎性改变及纤维化程度的比较(HE,苦味酸-天狼星红 ×200,标尺=100 μm) 苏木精-伊红染色结果可见各组手术区结膜组织中大量炎性细胞聚集,成纤维细胞增生;苦味酸-天狼星红染色显示各组手术区结膜组织胶原沉积;TGF组可见结膜组织下全层致密的红色胶原纤维沉积,LM609组及TGF+LM609组可见结膜下组织较为疏松的红色Ⅰ型胶原纤维以及部分呈绿色的Ⅲ型胶原组织 TGF:转化生长因子;LM609:整合素ανβ3受体阻断剂Figure 3 Inflammatory changes and the degree of fibrosis in the operative area of rats in various groups at 2 weeks after filtering surgery(HE,picric acid-sirius red ×200,bar=100 μm) A large number of inflammatory cells and the proliferation of fibroblasts were found in the conjunctiva in the operation area by hematoxylin-eosin staining.The collagen deposition in the conjunctiva in the operation area was found by picric acid-sirius red staining.The dense red collagen fiber deposition was found in the TGF group,and the loose red type Ⅰ collagen fibers and some green type Ⅲ collagen fibers were found in the LM609 group and the TGF+LM609 group TGF:transforming growth factor;LM609:integrin ανβ3 receptor antagonist
2.4 各组大鼠滤过术后2周手术区球结膜组织整合素αν、β3相对表达量比较
对照组、TGF组、LM609组和TGF+LM609组术后2周手术区球结膜组织整合素αν相对表达量分别为0.11±0.03、0.77±0.12、0.06±0.02和0.23±0.13,整合素β3相对表达量分别为0.09±0.06、0.63±0.08、0.12±0.04和0.13±0.05,各组间手术区结膜组织整合素αν、β3相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=56.550、93.380,均P<0.05);TGF组手术区结膜组织整合素αν、β3相对表达量明显高于对照组、LM609组和TGF+LM609组,差异均有统计学意义(均P<0.05),LM609组整合素αν、β3相对表达量与对照组及TGF+LM609组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。对照组与TGF+LM609组整合素αν、β3相对表达量比较差异均无统计学意义(P=0.240、0.090)(图4)。
图4 Western blot检测各组大鼠滤过术后2周手术区球结膜组织中整合素αν、β3表达变化的比较 A:各组整合素αν、β3蛋白表达电泳图 B:各组整合素αν蛋白相对表达量比较 F=56.550,P<0.05.与对照组比较,aP<0.05;与TGF组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验,n=3) C:各组整合素β3蛋白相对表达量比较 F=93.380,P<0.05.与对照组比较,aP<0.05;与TGF组比较,bP<0.05(单因素方差分析,LSD-t检验,n=3) 1:对照组;2:TGF组;3:LM609组;4:TGF+LM609组 β-actin:β-肌动蛋白Figure 4 Comparison of integrin αν and β3 expression levels in the rat conjunctival tissue in the operation area at 2 weeks after filtering surgery among various groups by Western blot A:Electrophoretogram of integrin αν and β3 protein expression among various groups B:Comparison of integrin αν relative expression levels among various groups F=56.550,P<0.05.Compared with the control group,aP<0.05;compared with the TGF group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) C:Comparison of integrin β3 relative expression level among various groups F=93.380,P<0.05.Compared with the control group,aP<0.05;compared with the TGF group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1:Control group;2:TGF group;3:LM609 group;4:TGF+LM609 group
2.5 各组大鼠滤过术后2周结膜组织整合素ανβ3表达及定位情况
对照组结膜组织可见大量整合素ανβ3阳性细胞,主要集中在手术区结膜组织;TGF组结膜组织全层均可见大量整合素ανβ3阳性细胞,角膜缘切口及微管周围分布较多;LM609组和TGF+LM609组结膜组织整合素ανβ3阳性细胞数量明显少于对照组和TGF组;TGF+LM609组结膜组织整合素ανβ3阳性细胞主要集中在微管周围组织中(图5)。
图5 免疫组织化学染色检测各组大鼠滤过术后2周手术区结膜组织整合素ανβ3定位表达情况(DAB ×400,标尺=20 μm) TGF组可见手术区结膜组织中大量整合素ανβ3阳性细胞(箭头),LM609组及TGF+LM609组阳性细胞(箭头)数量均明显减少 A:对照组 B:TGF组 C:LM609组 D:TGF+LM609组Figure 5 Expression of integrin ανβ3 in rat conjunctival tissues in the operation area at 2 weeks after filtering surgery by immunohistochemical staining (DAB ×400,bar=20 μm) In the TGF group,there were a large number of integrin ανβ3-positive cells (arrow) in the conjunctival tissue in the operation area,and the number of the positive cells (arrow) was significantly decreased in the LM609 group and the TGF+LM609 group A:Control group B:TGF group C:LM609 group D:TGF+LM609 group
3 讨论
整合素家族在各种组织中均有表达,介导细胞及细胞外基质之间的反应,调控细胞分化、增生与凋亡的各个过程,其中整合素ανβ3受体存在于破骨细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和某些肿瘤组织中的新生血管内皮细胞膜,参与细胞与基质、细胞之间的黏附,在肿瘤生长、局部浸润、转移以及新生血管生长过程中起着重要作用[12-16]。Soldi等[12]研究发现,整合素ανβ3介导内皮细胞与细胞外基质之间的黏附,对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体2的激活至关重要,整合素ανβ3协同强化VEGF-A165引起的VEGF受体2磷酸化及促有丝分裂作用,参与VEGF-A165对VEGF受体2的激活,从而促进血管的生成。在新生血管形成过程中,整合素与骨桥蛋白有协同作用,也可以诱导成纤维细胞聚集、增加细胞黏附侵袭能力,因此整合素也被称为新生血管的标志之一[16]。
研究表明整合素ανβ3在血管形成过程中与多种细胞因子具有协同作用,如碱性成纤维细胞生长因子、TGF-β、基质金属蛋白酶等,其中TGF-β是目前较为确定能上调整合素表达的因子[8,15]。在肝脏、肺脏等脏器纤维化的相关研究中发现整合素ανβ3可能在其中发挥调控胶原合成及肌成纤维细胞形成的重要作用[5,17-18]。有研究报道,在人的肺成纤维细胞中,整合素ανβ3与TGF-β Ⅱ型受体结合参与细胞增生的作用[5]。整合素ανβ3可能介导了肝脏星状细胞向肌成纤维细胞的表型转化,在肝纤维化过程中发挥重要作用[17]。在硬皮病来源的成纤维细胞中,TGF-β的促纤维化作用是通过整合素ανβ3介导[18]。本实验中大鼠青光眼滤过术后结膜组织成纤维细胞大量表达整合素ανβ3,TGF-β2可促进整合素αν、β3的表达,可能与术后结膜组织新生血管长入有关,在结膜瘢痕形成过程中起着重要作用。
目前关于TGF-β与整合素ανβ3之间相互作用的关系尚无定论。一些研究者认为TGF-β能促进整合素ανβ3的表达,但也有研究者认为TGF-β不能促进整合素ανβ3,或者能促进整合素αν表达但不能促进整合素β3的表达[6]。本研究结果显示,TGF-β2能促进大鼠滤过术后结膜组织中整合素αν、β3的表达和成纤维细胞中整合素ανβ3的表达。研究报道整合素ανβ3特异性阻断剂LM609可抑制结缔组织生长因子诱导的平滑肌肌动蛋白、I型及III型胶原表达,并抑制成纤维细胞的收缩[19]。本研究结果也显示,LM609可抑制大鼠滤过术后结膜组织中整合素αν、β3的表达,减少术后结膜组织胶原的沉积。Paikal等[20]研究发现,整合素α3、α2和α5特异性抗体可抑制人Tenon囊成纤维细胞的增生和迁移。
本研究结果显示,TGF-β2可以促进大鼠滤过术后结膜组织中整合素ανβ3的表达,结膜组织瘢痕形成显著,组织血管化,显著降低滤过泡生存率;抑制整合素ανβ3表达后,术后结膜组织胶原沉积及组织血管化均明显减少,滤过泡生存延长,提示TGF-β2可能通过整合素ανβ3参与结膜瘢痕形成过程,为术后抗瘢痕形成提供依据,但其具体作用机制仍有待进一步研究。
利益冲突本研究为遵义医科大学第三附属医院眼科和陆军军医大学大坪医院眼科联合完成项目,所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明朱晓燕:设计实验,研究实施,文稿书写;谢琳:指导实验进展,对文稿审阅修改;谭薇:设计实验,指导实验进展,审阅文稿