基于网络药理学和分子对接探讨钩藤-全蝎药对治疗支气管哮喘的作用机制＊

王国玉，渠 源，陈亚飞，贾新华

（1. 山东中医药大学第一临床医学院 济南 250011；2. 山东中医药大学中医学院 济南 250011；3. 北京中医药大学中医学院 北京 100029；4. 山东中医药大学附属医院 济南 250011）

支气管哮喘（Bronchial asthma，BA，以下简称哮喘）是一种常见慢性气道过敏性病变，全世界约有4.2%的人患有哮喘[1]，在我国该病的发生率呈逐年上升趋势[2]。哮喘临床主要表现为反复喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，与气候、运动、呼吸道感染或药物等因素相关，常在夜间症状发作或加重，好发于有哮喘家族史、肥胖、吸烟、变应原暴露及有过敏性鼻炎等并发症的人群。目前认为该病发病机制与气道炎症、气道高反应、气道重塑、变态反应、神经调节机制等多因素参与相关[3]。西医治疗多使用糖皮质激素、白三烯调节剂、β2受体激动剂、抗胆碱能及茶碱类药物，但部分患者对激素使用治疗依从性较差，且西药治疗存在一定程度的不良反应。

“钩藤-全蝎”药对是导师治疗哮喘的常用药对，临床疗效显著。钩藤，味甘，性凉，归肝、心包经，具有清热平肝、息风定惊的功效；全蝎味辛，性平，归肝经，具有息风镇惊、攻毒散结、通络止痛之用，两者配伍辛甘发散，相须为用，可增强息风止痉、通络止痛之效。现代药理学表明钩藤碱具有降压、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、改善血小板聚集及保护脑缺血缺氧等作用[4-5]；王盟等人实验发现钩藤碱固体纳米粒可能通过抑制TGF-β1 所诱导的Smad、MAPK 通路起到对哮喘的缓解作用[6]，同时钩藤可有效延长豚鼠哮喘发作的潜伏期[7]；全蝎具有镇痛抗炎、抗肿瘤、抗惊厥、抗凝、提高免疫力等作用[8]，然而有关钩藤-全蝎药对治疗哮喘的具体作用机制未见相关报道。网络药理学是基于系统生物学、网络生物学、多向药理学、计算生物学等，利用多种数据分析工具，构建疾病-靶点-药物的多层次关系网络，解析药物与疾病间关系的一门融合类交叉学科[9]。中药多靶点、多组成、多功效的特点与所治疗疾病的复杂对应关系正适合通过网络药理学进行构建与阐释[10]。本文主要基于网络药理学和分子对接技术分析钩藤-全蝎药对药物活性成分、预测靶点及其可能的分子作用机制，探求钩藤-全蝎药对对哮喘治疗的具体机制，为中医药临床治疗哮喘提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

Excel 2014 软件；Cytoscape 3.7.2 软件；R 软件；中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/）；中药综合数据库（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）；Uniprot（http://www. uniprot. org/）；人 类 孟 德 尔 遗 传 网（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/）；GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/）；Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）；Venny2.1绘制韦恩图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）；Open Babel 2.3.2 软件；Protein Data Bank 数据库（https://www.rcsb.org/）；Pymol 2.3.4 软 件；Autodock 4.2.6 软件；Autodock vina 1.1.2 软件；omicshare 软件、GraphPad Prism 8.3.0软件进行可视化处理。

1.2 钩藤-全蝎药对成分及靶点搜集

以“钩藤”为关键词，在TCMSP数据库检索对应的成分，根据吸收、分布、代谢、排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME）的药动学特性参数筛选活性成分。其中以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似性（Drug likeness，DL）≥0.18为筛选条件。其中以“全蝎”为关键词，通过在TCMID 数据库上搜集其成分（TCMSP 数据库未收录全蝎）。将所得到的成分通过TCMSP数据库进行靶点提取，并通过Uniprot数据库校正。

1.3 构建钩藤-全蝎药对成分-靶点网络

将钩藤-全蝎药对活性成分和靶点的信息导入Cytoscape 软件中，进行可视化成分-靶点网络并分析。节点度的大小表示网络中该节点与其他节点相连边的条数，节点度越高在网络中起到的作用越大，用节点的重要程度筛选钩藤-全蝎药对中的重要活性成分。

1.4 哮喘靶点搜集

以“asthma”为关键词，在GeneCards 数据库和OMIM 数据库中搜索疾病靶点，结果去重后经Uniprot数据库标准化校正。

1.5 钩藤-全蝎药对和哮喘共有靶点的筛选及PPI 网络构建

筛选钩藤-全蝎药对和哮喘的共同靶点，结果使用R 软件可视化。将共有靶点信息上传至String 数据库进行网络构建，将得到的靶点信息提交至Cytoscape软件中呈现，同时将所得的节点度进行分析后，通过节点颜色和大小呈现。

1.6 钩藤-全蝎药对和哮喘共有靶点富集

哮喘和钩藤-全蝎药对的共同靶点在David 软件进行GO 和KEGG 潜在靶点富集分析，筛选KDR（Q值）＜0.05 的前20 名生物过程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）、细胞组分（Cellular component，CC）和KEGG 通路，其中KDR 值越小，代表该生物过程或通路与钩藤-全蝎药对治疗哮喘的关系越密切，最后通过omicshare 软件进行可视化处理。

1.7 构建钩藤-全蝎药对和哮喘的“化合物-靶点-通路-疾病”网络

以选取钩藤-全蝎药对与哮喘共同的靶点基因，靶点基因涉及的重要通路，针对共同靶点基因的活性成分，疾病和药物名称这4 个方面为节点，在Excel 表格中整理化合物、靶点、通路、疾病、药物之间的对应关系并导入到Cytoscape 软件中，构建并分析钩藤-全蝎药对“化合物-靶点-通路-疾病”的网络药理图。

1.8 分子对接

分析选择PPI 网络中连接度值最高的7 个靶点，认为这7个靶点是药物治疗支气管哮喘疾病的关键靶点基因。选取钩藤-全蝎药对中关键活性成分，下载其化合物结构文件，并利用Open Babel 软件将MOL2文件转化为PDB 文件，将其作为配体；在Protein Data Bank查找相应受体蛋白，下载蛋白结构；使用Pymol软件和Autodock 软件对蛋白进行处理，采用Autodock vina 进行分子对接，结合能（Affinity）小于-5 kcal·mol-1表明结合活性较好，数值越小说明药物小分子与靶蛋白受体结合越稳定。

表1 钩藤-全蝎药对成分

2 结果

2.1 钩藤-全蝎药对成分及靶点信息

通过TCMSP 数据库搜索，根据设定ADME 筛选标准纳入钩藤成分33 个；通过TCMID 数据库，纳入全蝎成分4个，其中taurine、trimethylamine 药物相似性虽未到筛选要求，但考虑其口服生物利用度较高，故纳入其中（表1）。筛除重复项后，钩藤-全蝎药对共有37种成分，234个靶点。

2.2 钩藤-全蝎药对成分及靶点网络

将钩藤-全蝎药对成分和靶点导入Cytoscape软件后，软件显示（图1、表2）：Degree 前5 的成分分别是：槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、育亨宾碱（yohimbine）、甲基（E）-2-[(2S,3Z,12bS)-3-亚乙基-2,4,6,7,12,12b-六氢-1H-吲哚并[3,2-h]喹诺嗪-2-基]-3-甲氧基丙-2-烯酸酯（methyl (E)-2-[(2S,3Z,12bS)-3-ethylidene-2,4,6,7,12,12b-hexahydro-1H-indolo[3, 2-h]quinolizin-2-yl] -3-methoxyprop-2-enoate），Degree 分 别 为：78、35、17、16、16。

图1 钩藤-全蝎药对活性成分-靶点图

2.3 哮喘靶点信息

经过搜索后，在GeneCards 数据库中获得5973 个靶点，OMIM 数据库中获得43 个靶点，经去重、标准化处理后，得到哮喘相关靶点6010个。

2.4 钩藤-全蝎药对和哮喘共有靶点网络

将钩藤-全蝎药对和哮喘靶点导入Venny软件，筛选共有靶点，并使用韦恩图呈现（图2）。将共有靶点上传到String 数据库得到靶点间相互作用关系，输出关系信息提交到Cytoscape 软件中呈现（图3），核心网络图包括89 个节点，748 条边，平均度值为16.8，超过平均度值的有35 个，推测这35 个靶点是钩藤-全蝎药对作用于哮喘的关键靶点，并将其做成柱状图（图4），并删选Degree≥16.8 的节点。通过删选，钩藤-全蝎药对和哮喘共有靶点Degree 值前7 个靶点是IL6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、FOS、MAPK8（ 图3、图4）。

表2 关键活性成分的基本信息

2.5 共有靶点富集分析

GO 富集分析结果显示，生物过程主要包括对有机物质的反应、对化学物质的反应、细胞对有机环的反应、细胞对化学刺激的反应、信号传导过程、细胞通讯过程等方面；分子功能主要涉及相同的蛋白质结合、蛋白质二聚活性、离子结合、双链DNA 结合、酶结合、类固醇结合等方面；细胞组分主要与膜封闭腔、细胞器管腔、细胞内细胞器管腔、细胞质部分等有关（图5-图7）。信号通路主要涉及癌症通路、磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol-3-kinsae，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB）信号通路（又称PI3K/Akt 信号通路）、松弛素信号通路、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信号通路、C型凝集素受体信号通路、催乳素信号通路、癌症中的小分子RNA、癌症蛋白聚糖、内分泌抵抗等方面，同时与人类巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝、乳腺癌等感染类疾病和癌症密切相关（图8）。

2.6 钩藤-全蝎药对和哮喘的“化合物-靶点-通路-疾病”网络

利用Cytoscape 软件可视化钩藤-全蝎药对的“化合物-靶点-通路”网络。网络图直观地呈现了37种钩藤-全蝎药对活性成分、89个钩藤-全蝎药对和哮喘疾病的共同靶蛋白、26 条共同靶蛋白作用通路和哮喘之间关联，体现了作用靶点分布于不同的代谢通路，相互作用，共同影响钩藤-全蝎药对治疗哮喘（图9）。

图2 哮喘和钩藤-全蝎药对靶点韦恩图

图3 哮喘和钩藤-全蝎药对共有靶点PPI网络

2.7 分子对接

采用分子对接的方法，选取核心靶点IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、FOS、MAPK8与钩藤-全蝎药对关键成分槲皮素、山奈酚、育亨宾碱、β-谷甾醇、甲基（E）-2-[(2S,3Z,12bS)-3-亚乙基-2,4,6,7,12,12b-六氢-1H-吲哚并[3,2-h]喹诺嗪-2-基]-3-甲氧基丙-2-烯酸酯进行对接，从PDB 数据库中检索获得受体蛋白CASP3（PDBID: 2J32）、EGFR（PDBID: 6S9C）、ESR1（PDBID: 6VJ1）、FOS（PDBID: 1FOS）、IL6（PDBID:1ALU）、MAPK8（PDBID: 2XRW）、VEGFA（PDBID:1VPF），通过计算受体-配体复合物的空间效果、排斥作用、氢键、疏水相互作用以及分子的灵活性等值综合打分，评估其亲和力，最终给出亲和能打分，这种亲和能是衡量配体是否能与受体分子有效结合的重要指标，能值越低，二者的结合效果越好（图10）。

育亨宾碱与受体蛋白CASP3、MAPK8及槲皮素与受体蛋白ESR1、IL6分别结合，β-谷甾醇与EGFR 相结合（图11）。图A 为CASP3 与育亨宾碱相结合，氨基酸残基Ser209、Asn208 与育亨宾碱配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Arg207、Ser205、Tyr204、Phe256、Trp206、Phe250与配体小分子形成疏水相互作用；图B为EGFR 与β-谷甾醇结合模式，氨基酸残基Lys745、Glu762与β-谷甾醇配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残 基Phe723、Val726、Met790、Leu718、Leu792、Gly796、Asp800、Cys797、Met793、Leu844、Thr854、Asn842、Asp855 与配体小分子形成疏水相互作用；图C 为IL6 与槲皮素结合模式，氨基酸残基Asp34、Gln175、Arg179 与槲皮素配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Leu33、Leu178、Arg30 与配体小分子形成疏水相互作用；图D 为ESR1 与槲皮素配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Arg394、His524 与槲皮素配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残Leu349、Glu353、Ala350、Leu387、Leu384、Met421、Ile424、Phe425、Leu428、Leu404、Leu391 与配体小分子形成疏水相互作用；图E为MAPK8与育亨宾碱之间的结合模式，氨基酸残基Ser34 与育亨宾碱配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Lys55、Val40、Ala53、Met111、Val158、Asn114、Leu168、Ser155、Asp169、Lys153、Asn156、Gly35与配体小分子形成疏水相互作用。

图4 PPI网络中节点度大于平均值的共有靶点

图5 钩藤-全蝎药对活性成分对应潜在靶标的BP分析

3 讨论

图6 钩藤-全蝎药对活性成分对应潜在靶标的MF分析

图7 钩藤-全蝎药对活性成分对应潜在靶标的CC分析

支气管哮喘属于中医“哮病”之范畴，临床上多表现为发作性的痰鸣气喘，发时喉中有哮鸣音，呼吸气促困难，甚则喘息不得平卧。哮喘的病因如《症因脉治·哮病》所言：“哮病之因，痰饮留伏，结成窠臼，潜伏于内，偶有七情之犯，饮食之伤，或外有时令之风寒束其肌表，则哮喘之症作矣”，认为其发病因素与外感六淫、内伤七情、饮食劳倦等有关，其中病理因素以痰为主，与肺脾肾三脏对津液运化、布散、输布失常密切相关。哮喘发病存在反复性、发作性、季节性发作等特点，与伏邪的致病特点相似，大抵为痰阻肺络及较为细小的络脉中，受风邪为主的外感六淫邪气影响，伏而发病，同时与瘀、热、寒等病理因素相关。治疗上朱丹溪在《丹溪心法·哮喘十四》提出“哮喘必用薄滋味”的用药经验，早在《素问·阴阳应象大论》中便提到“味厚者为阴，薄为阴之阳。气厚者为阳，薄为阳之阴……味厚则泄，薄则通”“辛甘发散为阳，酸苦涌泄为阴”，认为薄味具有通达宣畅的作用，而后李东垣在《脾胃论》中提出“阳本根于阴，惟泻阴中之火，味薄风药，升发以伸阳气，则阴气不病，阳气生矣”，提出“味薄风药”的概念。结合哮喘的病因病机，笔者认为支气管哮喘急性发作期在治疗时应在化痰的基础，加用祛风通络类药物，如钩藤、全蝎之类，属于辛、甘类药物，《本草便读》中记载，全蝎“走脏腑，行经络”，“凡藤类之所属，皆可通经入络”，可有效改善脉络绌急气逆的病理状态，对哮喘发作时的气管痉挛状态有较好的缓解作用，临床应用疗效显著。

图8 钩藤-全蝎药对活性成分对应潜在靶标的KEGG富集分析

根据中药“活性成分-靶点网络”分析，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、育亨宾碱等很可能是关键作用成分。其中槲皮素可抑制白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α等气道炎症介质的分泌，降低肺组织NOD 样受体家族3（NOD-like receptors，NLRP3）、脂肪干细胞（Adipose-derived stem cell，ASC）、胱冬肽酶-1（Caspase-1，CASP1）的蛋白表达，减少血中嗜酸性粒细胞和IgE 的表达，升高干扰素γ的水平，从而改善支气管哮喘气道炎症，其机制可能与miR-155 或气道上皮Toll 样受体-4（Toll-like receptors-4，TLR4）/核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）表达下调有关[11-15]；山奈酚可以通过干预MAPK、PI3K 等信号通路的表达调节炎症介质的表达，减少相关炎症因子的分泌，调控促炎酶活性的活性，从而有效抑制炎症的产生[16]，或可通过干扰NF-κB 信号传导抑制气道上皮细胞的嗜酸性粒细胞浸润和气道炎症[17]；β-谷甾醇可能通过抑制细胞反应和随后的Th2细胞因子释放以抑制哮喘，同时降低TNF-α、IL-4、IL-5 等细胞因子的水平[18]。

图9 钩藤-全蝎药对与哮喘的“化合物-靶点-通路-疾病”网络模型

图10 分子对接结果

PPI蛋白互作网络结果显示IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、MAPK8 可能是钩藤-全蝎药对治疗哮喘的关键靶点。支气管哮喘主要是由于嗜酸性粒细胞增多、浸润所引起的一种病理改变，同时与嗜酸性粒细胞正常凋亡受到抑制密切相关，临床试验表明支气管哮喘病人的血清和痰液中IL-6 的水平明显提升[19]，而IL-6 主要通过IL-6/mIL-6R 信号通路、和IL-6/sIL-6R 复合物信号信号通路促进IL-4和IL-13的产生，从而加重气道炎症的同时抑制Treg 细胞，促进其他免疫反应的发生[20]。先前的实验中发现在哮喘过程中，气道上皮细胞表达高水平的EGFR，参与免疫应答和细胞重塑过程[21,22]，实验证明表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）在哮喘气道平滑肌细胞中被内皮素-1激活，并参与哮喘的气道重塑[23]。哮喘的性别差异可能与性激素的分泌有关，尤其是雌激素受体1（Estrogen Receptor 1，ESR1）基因的表达与变异，高水平的ESR1 表达可能有抗炎作用，可以有效抑制气道炎症[24]，且有试验证明雌激素具有抑制肺成纤维细胞的增殖的作用[25]。丝裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）即JNK，在哮喘的凋亡过程和气道重塑中具有显著作用[26]。

图11 分子对接结合模式

KEGG 富集分析结果显示，钩藤-全蝎药对主要通过PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、缺氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1）信号通路、MAPK信号通路、NF-κB 信号通路等来治疗哮喘。PI3K-Akt信号通路参与支气管哮喘的炎症、变态反应、气道重塑等多种病理过程，受转化生长于因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）、IL-25、炎 症 区 域1（Found in inflammatory zone 1，FIZZ1）等多种酶、细胞、基因片段的调控，其可影响炎症的增殖、聚集、活化、凋亡的调节，从而影响支气管哮喘发病[27,28]；实验研究也证实，通过对PI3K 信号进行干预可有效地抑制支气管哮喘的发生发展[29,30]。TNF 信号通路介导多种细胞内信号通路，包括细胞凋亡，细胞存活以及炎症和免疫反应，其TNF 作为其中的重要细胞因子，研究发现TNF-α对气道平滑肌有直接作用，且增加嗜酸性细胞对内皮细胞的细胞毒性作用，参与T细胞的激活，增加粘附分子的上皮表达等促进气道炎症和气道高反应[31-33]，有研究发现将TNF-α作为治疗哮喘的靶点在临床试验中有明显疗效[34]。HIF-1 信号通路可以激活几种炎症细胞因子、趋化因子和生长因子的转录，以及基质重塑蛋白（如胶原蛋白酶和基质金属蛋白酶），从而参与气道炎症和气道重塑[35]。MAPK 信号通路主要调节细胞增殖、凋亡、分化，调控机体炎症和免疫等方面，从而介导免疫/炎症细胞反应、气道结构细胞反应，调控Th1/Th2 比例影响其免疫应答过程参与支气管哮喘的形成和发展；有研究表明通过对该通路进行干预可有效改善气道重塑，抑制嗜酸性粒细胞在支气管黏膜下的浸润，对哮喘起到治疗作用[36]。NF-κB 信号通路主要是在细胞分化、凋亡，调节机体防御、组织损伤应激中起到信息传递作用，可以通过调控IL-1、TNF-α等促炎因子、黏附因子、生长因子和血管生成因子的转录过程及表达影响支气管哮喘的发作[37]；有研究表明通过阻断或抑制其信号传导过程可起到减少细胞因子和趋化因子的产生，拮抗哮喘发作时的氧化应激状态，从而达到对哮喘治疗的目的[38,39]，所以看出该信号通路不仅与哮喘的氧化应激有关，同时在气道重塑和气道炎症形成中关系密切。

分子对接显示，钩藤-全蝎药对的活性成分与CASP3、MAPK8、ESR1、IL6、EGFR 具有较好的亲和力，但其化合物治疗哮喘的活性需要进一步生物实验验证。

本研究通过网络药理学的方法对钩藤-全蝎药对治疗支气管哮喘的潜在靶点和机制进行预测，使用分子对接技术对其进行进一步验证，初步结果证实了钩藤-全蝎药对通过槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、育亨宾碱等活性成分作用于IL-6、CASP3、EGFR、ESR1、MAPK8等靶点治疗支气管哮喘的可行性，具有一定的可靠性，为进一步探讨其具体作用机制提供了新思路。但结果也需进一步的基础和临床实验验证。