阳明病（阳明腑实证）欲解时TNF-α的变化及大承气汤干预作用的实验研究＊

石 琳，李冰鹄，张广梅，赵协慧，王树林，陈湘宏，刘占厚，吴 萍

（青海大学医学院 西宁 810001）

张仲景在《伤寒杂病论》首提六经辨证论治体系，在六经病学说中，阳明病隶属于里证、实证，主要指病邪客于胃肠或邪气源于胃肠的里实证。《伤寒论》180条：“阳明之为病，胃家实也。”胃家，包括足阳明胃以及手阳明大肠。《灵枢·本输》谓：“大肠、小肠皆属于胃。”实乃邪气实。阳明胃腑为水谷之海，多气多血，阳明病易从燥化、热化。阳明病主要以胃肠燥、热、实为病变特征，当燥热之邪与胃肠宿滞相搏，结成燥屎，以致肠道不通，而见腹满硬痛、不大便，甚或谵语、潮热等，形成阳明腑实证。研究表明，阳明腑实证时存在严重的肠道屏障功能受损[1]，出现肠源性内毒素血症（Intestinal endotoxemia，IETM）和肠道菌群移位，两者作为诱发因子诱使机体炎症反应失控，进而表达、产生、释放大量炎症介质[2-4]。

张仲景《伤寒论》提出的“欲解时”[5]概念是中医天人相应思想的进一步发展。伤寒论193 条：“阳明病，欲解时，从申至戌上。”认为申至戌时正是太阳西下，阳气衰减之时，人体热邪顺应阳气衰减而下消，若加上正确有效的治疗，有利于阳明热邪外出，使病情发展趋于向好的时刻。大承气汤出自张仲景的《伤寒杂病论》，具有竣下热结之功，是泻法的代表方剂[6]，也是治疗阳明腑实证的主要方剂。研究表明，大承气汤具有降低炎性细胞因子、抑制血清内毒素、抗炎、提高机体免疫力等药理作用，对重要组织脏器具有保护作用[7]。目前六经病“欲解时”相关研究较少，本研究以阳明腑实证模型大鼠为研究对象，观察阳明病“欲解时”（酉时）及其对时（卯时）TNF-α 含量的变化及大承气汤干预效果，为临床择时治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠290 只，体质量（178 ± 23）g，雌雄各半，由西安交通大学医学部实验动物中心提供（许可证号：SCXK（陕）2017-003）。

1.1.2 试剂与仪器

TNF-α 酶联免疫试剂盒（美国云克隆生物研究所提供）。常规手术器械；超纯水纯化仪（Milli-Q，美国默克密理博有限公司）；DCNSG 多功能提取浓缩机组（上海达程实验设备有限公司）；TDL5M 低速冷冻离心机；RT-2100 酶标仪与洗板机（深圳雷杜公司）；PY-2型恒温箱（上海公私合营国光医化仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 分组

分笼适应性喂养1 周后，随机分为正常组90 只、模型组100只，大承气汤组100只。

1.2.2 药物制备

①造模热药液：根据实验大鼠体质量按每只20 g·kg-1体质量计算总药量，附子、肉桂、干姜以1:1:1量（购于青海省新绿洲药业有限公司，由青海大学医学院药学系鉴定），加水浸泡30 min，水煎2 次（40 min/次），每次煎完用双层清洁纱布过滤药汁，将两次煎液合并，加热浓缩至含生药量2 g·mL-1，4℃冰箱保存备用。用时将药液加热至37℃。②粪便混悬液：收集大鼠自身粪便磨碎，置于蒸馏水中，配制成10%混悬液。③注射用LPS 制备：大肠杆菌LPS 使用前以1.6 g·L-1浓度溶于灭菌去离子水中。④大承气汤液：芒硝、大黄、枳实、厚朴以3∶4∶5∶5 比例，枳实、厚朴加水浸泡30 min，水煎40 min 取汁，入大黄，水煎（2 - 3）min 取汁，入芒硝溶化，双层清洁纱布过滤，加热浓缩至2 g·mL-1，4℃保存备用。

1.2.3 模型复制及给药方法

参照樊新荣等[8]造模方法，建立阳明腑实证动物模型。

实验第1-12天：模型组、大承气汤组大鼠每天按每只20 g·kg-1剂量灌热药液，正常组灌等量蒸馏水，每5 天称重1 次以调整药量，连续灌胃12 天。第13-14天：禁食不禁水12 h 后，模型组、大承气汤组大鼠给予自身粪便混悬液灌胃，2 mL/只，正常组灌等量蒸馏水，2 次/日，连续2 天。第15 日：正常组、模型组、大承气汤组再次随机分为欲解时组与非欲解时组，模型组、大承气汤组欲解时组于当日14:00、非欲解时组于次日凌晨2:00 予以5 mg·kg-1脂多糖腹腔注射，正常组欲解时组当日14:00、非欲解时组次日凌晨2:00大鼠腹腔注射生理盐水。

模型判定：①大鼠进食量较少，行动迟慢，精神萎靡不振，体质量略有下降，挣扎无力，排便干结且次数减少，偶有成硬球；②体温先降低后升高。同时具备2个条件提示造模成功。造模成功后，非欲解时和欲解时大承气汤组于每日5:00、17:00 予以大承气汤2 mL·100 g-1灌胃，正常组和模型组灌等量蒸馏水，2 次/日。观察大承气汤组大鼠肛周污物明显增加，泻下稀溏样便后分别在阳明病欲解时中心时（酉时）17:00-19:00随机取欲解时模型组、大承气汤组大鼠10 只，正常组大鼠9只，阳明病欲解时中心时对时（卯时）5:00-7:00随机取非欲解时模型组、大承气汤组大鼠10 只，正常组大鼠9只，剪断大鼠颈部将其断头处死，将老鼠规定在鼠板上，逐层分离下腹部，截取小肠中段组织，预冷的生理盐水漂洗干净，注射器冲洗肠管内部，称取0.1 g 肠组织块数段，收集于冻存管中，-80℃冰箱保存制备组织匀浆。连续取材5天。

1.2.4 效应指标及检测方法

标准品的稀释、加样与测定根据试剂使用说明书的要求，配置大鼠TNF-α 标准溶液，并在板孔内稀释为不同浓度梯度，复孔制作标准曲线。设空白和质控复孔，空白孔加100µL 标准品稀释液，余孔加大鼠组织匀浆100µL，酶标板覆膜，37℃温育1 h。弃去液体甩干后每孔加检测溶液A 工作液100 µL（临用前配制），酶标板覆膜，37℃温育1 h。弃去孔内液体，每孔用350 µL 的洗涤液洗涤，浸泡（1-2）min，重复洗板3次。每孔加检测溶液B 工作液（临用前配制）100µL，酶标板覆膜，37℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5 次。每孔加TMB 底物溶液90µL，酶标板覆膜，37℃避光显色。每孔加终止溶液50µL，终止反应，确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值。

1.2.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，检验水准α= 0.05，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

模型组、大承气汤组大鼠给予12天热药灌胃后出现体质量降低，竖毛，活动增加，饮水量增加，尿量减少、发黄；给予自身粪便混悬液后出现排便时间延长，大便干结，呈串珠、圆珠状；腹腔注射脂多糖后，实验大鼠进食量减少，行动迟慢，精神不佳，体质量略有下降，排便次数减少，粪便干结，肛温先降低后升高；大承气汤组大鼠给予大承气汤干预后精神状态差，活动减少，抓取时反应较快，呼吸较为急促，饮食饮水量有所增加，大小便次数增多，且肛周污物明显增加或大便稀溏。

2.2 实验大鼠各组TNF-α含量变化

结果显示，模型组、大承气汤组阳明病非欲解时第4 天TNF-α 表达高于正常组（P＜0.01），欲解时第1-3 天TNF-α 表达均高于正常组（P＜0.01）。欲解时大承气汤组第3、4 天TNF-α 表达与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。模型组欲解时第1、2、3 天TNFα 表达高于非欲解时（P＜0.01），大承气汤组第1、3 天TNF-α表达高于非欲解时（P＜0.01），第4天低于非欲解时（P＜0.05）（表1、表2）。

表1 阳明病非欲解时各组TNF-a比较（pg·mL-1,±s）

表1 阳明病非欲解时各组TNF-a比较（pg·mL-1,±s）

注：同一天同一时点与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

时间第1天第2天第3天第4天第5天阳明病非欲解时（5-7时）正常组（N=9）129.79±0.218129.98±0.210129.56±0.056129.59±0.067130.13±0.146模型组（N=10）129.80±0.118129.97±0.138129.56±0.033129.88±0.120**130.15±0.260大承气汤组（N=10）129.75±0.182130.10±0.082129.57±0.029129.94±0.254**130.07±0.301

表2 阳明病欲解时各组TNF-a比较（pg·mL-1,±s）

表2 阳明病欲解时各组TNF-a比较（pg·mL-1,±s）

注：同一天同一时点与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；同一天同一时点与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；模型组同一天不同时点比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；大承气汤组同一天不同时点比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

时间第1天第2天第3天第4天第5天阳明病欲解时（17-19时）正常组（N=9）129.94±0.278129.98±0.232129.61±0.084129.89±0.243130.07±0.178模型组（N=10）130.23±0.292**△△130.32±0.115**△△129.87±0.158**△△130.00±0.192130.09±0.209大承气汤组（N=10）130.42±0.172**▲▲130.24±0.221**130.24±0.232**＃＃▲▲129.71±0.078＃＃▲130.05±0.116

2.3 实验大鼠各组TNF-α时间节律性变化

正常组TNF-α 表达与模型组、大承气汤组相比呈低趋势（P＜0.01）。模型组TNF-α 表达第2 天达到高峰，第3 天降至最低，之后趋于平稳；欲解时TNF-α 表达高于非欲解时。大承气汤组TNF-α 表达第1-3 天与模型组节律存在一致性，但其表达量高于模型组，第4 天明显降低（P＜0.05），第5 天各组间趋于一致（图1）。

图1 实验大鼠各组第1-5天TNF-a节律变化

3 讨论

《素问·生气通天论》曰：“故阳气者，一日而主外。平旦人气生，日中而阳气隆，日西而阳气已虚，气门乃闭。”人与自然、天地相参，人体阳气的盛衰变化、运行规律与一天内阳气变化大体一致。阳明之气旺于申酉戌时（15:00-21:00），这段时间是太阳落山前后的6个小时，此时自然界中的阳气逐渐衰退，借助逐渐衰退的阳气，可使体内之热随自然界阳衰而逐渐减退，故言阳明病于此时欲解。

阳明腑实证是多种急性腹部疾病中出现的一种证候，如急性阑尾炎、急性胆道感染、肠梗阻等，阳明腑实证能使肠道病变加重，严重时引起多器官功能衰竭等并发症。现代研究表明阳明腑实证的发生和内毒素血症密切相关。阳明腑实证由于宿食积滞、燥屎内结，肠道内大量积气，肠道压力明显升高[9]，同时肠道菌群失调，肠道黏膜屏障受损，肠道通透性明显升高，肠道内革兰阴性菌死亡后细胞壁崩解或活菌释出内毒素，释放入血形成肠源性内毒素血症[10]。大量内毒素（Endotoxin，ET）与细胞上的CD14 相结合，构成LPS-CD14 受体，此受体作用于TLR4，进而激活LPSTLR4/NF-κB 信号通路，通过MyD88 蛋白转导，激活NF-κB，NF-κB 进入细胞核，调控众多炎性递质的基因表达，促进TNF-α、IL-1β等细胞因子的表达[11]。该病乃危重急症，如不及时干预，释放入血的诸多炎症介质进一步激活炎症细胞通路，导致严重的组织损伤、功能破坏[12,13]，最终导致多器官功能障碍（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS），甚至死亡。

TNF-α 是一类具有多种生物效应的细胞因子，在信号传导和介导T淋巴细胞增殖上发挥重要作用。研究表明，内毒素与内皮细胞、单核细胞等细胞膜上的受体相结合，激活核因子κB（NF-κB）信号通路，促进一氧化氮（Nitric oxide，NO）、肿瘤坏死因子-a（Tumor necrosis factor，TNF-α）及白介素-1（Interleukin-1，IL-1）等大量炎性因子的分泌与释放，诱发炎性级联瀑布反应，从而造成组织器官受损[14]。本实验中，总体来看，模型组大鼠TNF-α 表达较空白组高（P＜0.01），因为大鼠机体免疫调节是动态过程，非欲解时模型组大鼠TNF-α 表达较低，随后TNF-α 表达逐渐升高，至同一天欲解时模型组大鼠TNF-α 表达高于空白组（P＜0.01），说明体内处于炎症反应状态。研究表明：TNFα 等细胞因子在受到LPS 或PHA 刺激后显示昼夜波动，与刺激后的增殖反应与淋巴细胞数相对应，淋巴细胞DNA 合成的昼夜节律亦呈双峰型，第1 个峰值出现在8:00-10:00 时，第2 个在20:00-24:00 时，谷值位于4:00 时[15]。这和本实验TNF-α 表达的峰值、谷值相近。《伤寒论》中的六经病“欲解时”简单来说，就是在某个时刻，该经正气旺盛，抗邪更加有力。从中医角度来看，TNF-α 作为炎性因子，是邪气的一种表现，TNF-α 高表达可从侧面说明机体正邪交争之激烈，疾病可能相愈。本实验TNF-α 阳明病欲解时与非欲解时的表达显示出昼夜节律。尤在泾在《伤寒贯珠集》指出：“申酉戌时，日晡时也。阳明潮热，发于日晡，阳明病解，亦于日晡。则申酉戌为阳明之时。其病者，邪气于是发。其解者，正气于是复也。”[16]说明在阳明欲解时TNF-α 的高表达，既是由于细胞因子大量释放，炎症风暴的发生，造成机体损伤，使疾病迅速恶化的时期；但也是通过免疫功能的调动，有利于疾病康复的时间。同时在阳明腑实证5 天的观察中发现，模型组TNF-α 表达在阳明病第1 天上升，第2 天达到峰值，72 h 达到最低值，之后趋于平稳，这与许翠萍[17]等人研究相似，在疾病急性期时TNF-α释放增加。

大承气汤是《伤寒论》中治疗阳明腑实证的代表方，由大黄、厚朴、枳实、芒硝四味药组成，具有泻下通里、竣下热结的功效，主治大便不通、腹中转矢气、腹满疼痛、拒按、潮热、手足截然汗出、脉迟有力。此时痞、满、燥、实诸证具备，故以大承气汤攻下。原文指出：“伤寒若吐若下后不解，不大便五六日，上至十余日，日晡所发潮热，不恶寒，独语如见鬼状。若剧者，发则不识人，循衣摸床，惕而不安。微喘直视，脉弦者生，涩者死。微者，但发热谵语者，大承气汤主之。”研究表明，具有下法的中药能降低肠腔压力，具有抗过氧化物损伤的作用，降低肠道内压力，改善肠壁循环，减轻过氧化物损伤，并对肠道屏障功能具有保护作用，有利于维持水、电解质平衡[18]。君药大黄可通过维持肠粘膜细胞的正常结构、防止或修复肠粘膜萎缩及损伤、保护肠粘膜完整性[19-20]。大黄的泻下作用和总蒽醌的成分有关，大黄蒽醌类成分是泻下的有效成分[21]。芒硝、厚朴、枳实和大黄配伍，能显著增加大黄中蒽醌类成分的溶出率[22]。芒硝的泻下作用的主要物质基础和与硫酸钠密切相关[23]。芒硝所含的Na2SO 可使肠内渗透压升高，大量水分保留到肠腔，引起机械性刺激，导致排便。厚朴能缓解实验大鼠胃肠动力障碍，促进小肠推进率[24]。厚朴的功效成分厚朴酚通过抑制氧化应激减轻细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤（Acute lung injury，ALI），下调大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量[25]。下调丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 的磷酸化水平，下调NF-κB 信号通路中核因子κB 抑制因子α（IkBa）、p65 的磷酸化水平而有明显的抗炎活性[26]。厚朴酚还有广谱抗菌活性，对白色念珠菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有抑制作用[27]。枳实苦降，善，破气除痞，消导积滞。四药合用，具有强大的荡涤肠道、峻下热结的功效。

研究表明，大承气汤具有减轻机体炎症反应的作用[28-30]。季永欣[31]等研究大承气汤能有效防治急危重症患者肠功能障碍并改善临床预后，其机制可能与调节TLR/MyD88/NF-κB-p65 信号通路过度激活及其下游炎症因子（IL-1β/IL-6/IL-8/TNF-α）有关。本实验给予大承气汤干预后，非欲解时组间差异不明显（P＞0.05），第4 天药物组TNF-α 仍高表达，猜测可能此时药物泻下作用发挥不充分或和动物免疫昼夜节律表达相关。整体上在非欲解时点，TNF-α 没有较明显下降趋势（P＞0.05），第4 天仍是一个高表达状态；欲解时药物组前3 天TNF-α 升高，第3 天明显高于模型组（P＜0.01），至第4 天明显低于模型组（P＜0.01），第5天组间无差异。且药物组1、3 天欲解时TNF-α 表达高于非欲解时（P＜0.01），第4 天低于非欲解时（P＜0.05），说明1-3 天处于疾病急性期，机体受LPS 刺激后增殖反应加剧，尽管给予药物干预，但此时邪气较为旺盛，正邪交争剧烈，故欲解时TNF-α 高表达且高于模型组，第4 天机体正气胜邪，故TNF-α 表达下降，尤以欲解时明显（P＜0.05），此时机体借助药物及自然界阳气变化而驱邪外出。本实验给予大承气汤干预后，欲解时组TNF-α表达总体上有下降趋势。

综上所述，大承气汤可抑制下游炎性因子TNF-α表达，且在欲解时给药效果显著。阳明腑实证是一个临床急性病，需要尽早干预。本实验初探了对于阳明病（阳明腑实证）的欲解时的时间治疗学意义，利用阳明病欲解时的有效时机，给予合理药物干预，能促使疾病向好的方向变化。本实验选取了阳明病欲解时中心时酉时（17:00-19:00）及其对时卯时（5:00-7:00）两时点进行研究，但阳明病（阳明腑实证）欲解时本身是一个时间段，其他时点的探究需进一步挖掘。