血根碱硫酸盐高效液相色谱分析方法研究

刘 伟， 李智文， 赵 柳， 沈莹华， 段 鹏

(1.陕西省农业检验检测中心，陕西 西安 710003；2.陕西先农生物科技有限公司，陕西 西安 710018)

血根碱硫酸盐又名硫酸血根碱、血根碱等，化学名称为：1，3-二氧杂环戊烯并[4'，5'：4，5]苯并[1，2-c] [1，3]间二氧杂环戊烯并[4，5-i]菲啶-13-硫酸盐[1]，化学结构式：C40H28N2O12S，(图1)所示，是从罂粟科(Papaveraceae)博落回属(Macleaya)多年生草本植物博落回中提取的异喹啉类生物碱，具杀虫、杀菌活性的一种植物源农药[2]。由于其不易气化，在水溶液中又极易离解成有机阳离子，加之提取过程含有大量其他杂质，故不易分析。本文参考相关文献[3-6]，对血根碱硫酸盐的检测波长、流动相及配比等高效液相色谱分析条件进行了选择与优化，并对该方法的最小检测量、精密度和准确度作了研究。

图1 血根碱硫酸盐的化学结构式

1 试验部分

1.1 试剂和溶液 乙腈：色谱纯；三氟乙酸：分析纯；水为新蒸二次蒸馏水；氯化血根碱标样：已知质量分数≥98%；40%血根碱母药试样。

1.2 仪器 高效液相色谱仪：Agilent1100，具可变波长紫外检测器和自动进样器、色谱工作站；C9860A超声波清洗器；色谱柱：Nova-Pak C18(250mm×4.6mm，5μm)不锈钢柱；过滤器：滤膜孔径0.45μm。

1.3 液相色谱分析条件 以乙腈+为流动相，采用梯度洗脱，流动相比例和流速设定(表1)；柱温：室温(温度变化<2℃)；检测波长：276nm；进样体积：5μL，血根碱保留时间约7.1min。典型的血根碱标样及其母药的高效液相色谱图(图2、图3)

表1 梯度洗脱流动相配比和流速设定

图2 氯化血根碱标样高效液相色谱图

图3 硫酸血根碱母药高效液相色谱图

1.4 测定步骤

1.4.1 标样溶液的配制 称取氯化血根碱标样约0.007g(精确至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并定容，作为标样储备液。

用50%乙腈水溶液溶解对上述标样储备液进行梯度稀释，配制系列浓度(浓度范围覆盖样品中有效成分质量分数的80%～120%)标样溶液，作为有效成分质量分数和线性范围测定标准溶液。

1.4.2 试样溶液的配制 准确称取40%血根碱母药样品约0.05g(精确至0.000 2g)于25mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并定容。取上述溶液2mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容并摇匀，作为样品溶液。7次平行配制样品溶液，作为方法精密度和有效成分质量分数测定溶液。

分别准确称取3份已知质量分数的40%血根碱母药约0.025、0.035和0.045g(精确至0.000 2g)于25mL容量瓶中，用50%乙腈水溶液溶解并定容。取上述溶液2mL，分别添加标准储备液(65.78mg/L)2.0mL于10mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，作为回收率测定溶液。

1.4.3 测定 在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针血根碱峰面积相对变化<1.5%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进样分析。

1.4.4 计算 试样中血根碱的质量分数X1(%)按式(1)计算、硫酸血根碱的质量分数X2(%)按式(2)计算：

(1)

(2)

式中：

A1—标样溶液中，血根碱峰面积的平均值；

A2—试样溶液中，血根碱峰面积的平均值；

m1—标样的质量，g；

m2—试样的质量，g；

P—标样中血根碱的质量分数，%；

332.3—血根碱离子的分子质量(按2012年国际相对原子质量计)；

367.8—氯化血根碱的分子质量(按2012年国际相对原子质量计)；

760.4—硫酸血根碱的分子质量(按2012年国际相对原子质量计)。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择 在190～400nm紫外吸收波长下，对血根碱进行扫描(图4)，发现其最大吸收波长为285nm，考虑到相关杂质吸收干扰和紫外检测器最适宜的波长范围，我们最终选择了276nm为血根碱液相色谱的检测波长。实验结果显示在此波长下，血根碱吸收峰面积较大、稳定，并且不受干扰。

色谱柱选择常用的Nova-Pak C18反相柱。用50%乙腈水溶液溶解样品。流动相使用乙腈和0.1%三氟乙酸水溶液，将二者按不同比例在色谱柱上进行试验，最终确定采用梯度洗脱，流速1.0mL/min，先充分分离、再快速洗脱。该条件下，有效成分与杂质能得到很好的分离，峰形对称，基线平稳，并且缩短了分析时间，提高了工作效率。样品目标峰光谱纯度为999.9(图5)。

2.2 分析方法的线性相关性试验 采用倍数稀释法，用50%乙腈水溶液稀释标样储备液，在82.2～328.9mg/L范围内准确配制血根碱标样系列浓度溶液，在规定色谱条件下进行方法线性范围测定。标准工作溶液的测定结果(表2)，标准工作曲线(图6)。

图4 血根碱紫外吸收谱图

图5 血根碱母药特异性谱图

结果表明：血根碱在82.2～328.9mg/L范围内，具有良好的线性关系，其色谱峰面积对浓度的回归方程为y=13.081x+76.63，R2=0.999，符合定量要求。

表2 血根碱标准工作溶液的色谱测定结果

图6 血根碱高效液相色谱标准曲线

2.3 分析方法的精密度试验 从同一样品中准确称取7个试样，在上述色谱条件下进行测定，测得的变异系数(RSD)为1.07%，小于Horwitz 公式计算出的RSDr1.56%。

表3 分析方法精密度测定结果

2.4 分析方法的准确度试验 从已知质量分数为36.27%的样品中称取3个试样，分别添加已知浓度(65.78mg/L)的血根碱标样溶液2.0mL，添加浓度为26.31mg/L，进行回收率测定，测定结果(表4)。血根碱的平均添加回收率为100.99%，SD为0.56%，RSD为0.55%。

表4 分析方法准确度测定结果

3 结语

实验建立了一种简单、快捷的分析方法来测定血根碱母药的质量分数。试验结果表明，其方法在一定的质量浓度范围内具有良好的线性关系，方法准确度和精密度均能满足定量分析的要求，具有操作简单易行，分析快速等特点，是产品质量控制和应用研究中较为实用的方法。