蟾蜍无痛麻醉技术在机能学实验中的应用探究

孙岑岑 梅汝焕 郑 燕 方 瑜 于晓云 厉旭云 王梦令 高铃铃

浙江大学医学院基础医学实验教学中心，浙江省杭州市 310058

蟾蜍的基本生命活动和生理功能与温血动物近似，其离体组织和器官所需的生活条件较为简单，常用于神经生理、肌肉生理、心脏生理等实验[1]。在高等医学院校实验教程中采用双毁髓法处理蟾蜍，是给予实验蟾蜍手术疼痛处理方法的唯一动物福利[1]；该方法在学生实验中，由于枕骨大孔刺入位置不准、插入过深过浅等原因，往往不能及时顺利完成毁脑脊髓工作，给蟾蜍带来长时间的巨大痛苦，抑或操作不当，发生蟾汁喷射到操作者眼睛等安全事件。其实，两栖类动物实验研究中的毁脑脊髓法，在国外普遍已被麻醉剂法取代，不少学者呼吁放弃使用毁脑脊髓法、淋巴囊注射法或冷冻法用于两栖动物的制动处理，以最大限度减轻对实验动物的伤害[2-3]。然而，由于毁脑脊髓法对心脏和神经—腓肠肌损伤最小，且尚未找到合适的替代方法(对心脏和腓肠肌标本无影响，且最大限度地降低对实验动物的损伤)，双毁髓法仍是国内尤其是教学实验中最普遍使用的方法。亦有研究报道可用淋巴囊注射乌拉坦麻醉法替代毁脑脊髓法用于蟾蜍心脏实验[4]，但淋巴囊注射对于实验技术要求更高，不易掌握，不适合在教学实验中运用。因此，为了更加科学、合理、人道地使用实验动物，探索新的蟾蜍制动方法以取代教学实验中的毁脑脊髓法具有重要意义。

蟾蜍神经—腓肠肌兴奋与收缩实验和离体心脏实验是最为常见和经典的生理教学实验，对于学生深入认识和理解神经肌肉兴奋收缩和心肌收缩调控的基本生理学知识具有重要意义[1]。为此，本研究选择上述两个蟾蜍实验作为研究背景，选用多种麻醉剂处理蟾蜍，检测各麻醉剂对蟾蜍神经—腓肠肌和心肌的影响，以筛选最佳替代毁脑脊髓的方法，从而最大限度减少实验过程对动物机体的损伤，减轻动物遭受的痛苦和应激反应，并获得客观、科学的实验研究数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)实验动物：健康中华蟾蜍指名亚种(Bufo gargarizans gargarizans Cantor，Zhoushan Toad)，雌雄不均，由浙江大学动物实验中心提供。实验过程中所有的操作均符合动物福利的要求。(2)实验试剂：异丙酚，分析纯，购于力邦制药，批号H20010368；戊巴比妥钠，分析纯，购于sigma，货号 P3761；氨基甲酸乙酯，分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司，货号3019228；MS-222，分析纯，购于Adamas，货号88345。(3)实验仪器：张力换能器(成都仪器厂)，RM6240BD型生物信号采集处理系统(成都仪器厂)等。

1.2 实验方法 (1)实验动物的分组与处理：将蟾蜍[中华蟾蜍指名亚种，(120±15)g]按体重和性别平均分到五组，分别为毁脑脊髓组(采用传统的毁脑脊髓的方法处理蟾蜍)；异丙酚组(浓度10g/L, 1ml/100g进行腹腔麻醉)；戊巴比妥钠组(浓度2%，0.4ml/100g进行腹腔麻醉)；氨基甲酸乙酯组(浓度10%，2ml/100g进行腹腔麻醉)；MS-222组[1g/L MS-222溶液(NaHCO3调至pH 7.2～7.4)中浸泡10～15min即可麻醉][2,5]。(2)在体蟾蜍神经—腓肠肌兴奋收缩实验：采用不同方法制动处理的蟾蜍，分离坐骨神经和腓肠肌，利用RM6240对腓肠肌收缩的各项指标进行测定。①阈强度：前负荷2.5g，波宽0.1ms，波间隔1 000ms,测定不同刺激强度下的收缩张力；②最适前负荷：最大刺激强度为本次实验的刺激强度，波宽0.1ms，波间隔1 000ms，测定不同前负荷下的收缩张力；③最适波间隔的测定:最大刺激强度和最适前负荷作为本次实验的刺激强度和前负荷，波宽0.1ms，脉冲数2个，测定不同波间隔下的收缩张力；④最适肌肉持续兴奋时间：最大刺激强度、最适前负荷和最适波间隔作为实验刺激参数，波宽0.1ms，测定不同脉冲数时的收缩张力。(3)蟾蜍离体心脏实验：采用不同方法制动处理的蟾蜍，分离制备蛙心标本并进行蛙心插管，与张力换能器连接。①不同麻醉剂对蛙心搏动的影响：向插管中加入1ml任氏液，心搏曲线稳定后记录正常的心搏曲线45s，并测定蛙心最大收缩压(EST)、最大舒张压(EDT)、心率(HR)。②不同药物对蛙心搏动的影响：向灌流液(1ml)中加入不同药物(0.5% CaCl2溶液25μl、1.5% KCl溶液20μl、6×10-6mol/L乙酰胆碱15μl、肾上腺素溶液10μl), 心搏曲线稳定后记录45s数据。每次实验后均用任氏液反复冲洗以去除药物残留。

1.3 评价指标 骨骼肌收缩张力的大小与前负荷、刺激强度、刺激时间、刺激频率等有关，刺激参数不同，骨骼肌的收缩张力也不同。故分别选择阈刺激强度，最大刺激强度、最适前负荷、最适波间隔、最适兴奋持续时间及其相应的收缩力作为评价指标，对坐骨神经—腓肠肌的兴奋收缩性能进行多方面的评估。心脏的兴奋收缩性能可通过最大收缩压(EST)、最大舒张压(EDT)、心率(HR)进行评价，细胞外液的钠、钾及钙等离子对心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性和收缩性产生影响。故选择EST、EDT和HR作为评价指标，对不同麻醉制动处理的离体心脏及其药物处理前后的兴奋收缩性能进行测定，比较并评价不同麻醉剂对心脏的影响。

1.4 统计学方法 所有的实验重复至少3次。实验数据使用SPSS13.0软件进行分析，计量资料以平均值±标准差表示，显著性差异通过two-tailed Student’st-test进行分析计算。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同麻醉剂对腓肠肌收缩张力的影响 分别用戊巴比妥钠、氨基甲酸乙酯、异丙酚和MS-222对蟾蜍进行麻醉处理，毁脑脊髓组作为对照，检测不同麻醉剂对坐骨神经—腓肠肌兴奋与收缩的影响。结果显示，在2.5g前负荷、0.1ms波宽单刺激条件下，各麻醉组样本的最大刺激强度均与毁脑脊髓组无明显区别，但MS-222、戊巴比妥钠组腓肠肌阈刺激强度显著高于毁脑脊髓组，而最大收缩张力明显低于毁脑脊髓组；氨基甲酸乙酯组腓肠肌的阈强度与毁脑脊髓组比无显著性差异，但最大收缩张力明显低于毁脑脊髓组；而异丙酚组腓肠肌的各项指标(阈强度、最大刺激强度及收缩张力)均与毁脑脊髓组无显著性差异(P>0.05)。见表1、图1A～B。故选择异丙酚麻醉组进行后续的神经—腓肠肌研究。见图1。

表1 不同麻醉剂制动处理的坐骨神经—腓肠肌的阈刺激和最大刺激强度及相应的收缩张力

2.2 异丙酚对腓肠肌收缩的影响 用异丙酚对蟾蜍进行麻醉处理，对不同刺激条件下的腓肠肌收缩张力进行测定。结果显示，异丙酚麻醉组和毁脑脊髓对照组的腓肠肌收缩变化趋势均一致，无明显差异(P>0.05)。二者的最适前负荷、最适波间隔及最适兴奋持续时间均无显著性差异(P>0.05)。见图1C～E。同时，在最适前负荷、最适波间隔、最适肌肉持续兴奋时间、最大刺激强度的电刺激作用下，异丙酚组的腓肠肌达到最大收缩张力为(335.99±40.52)g，与对照组的(348.11±36.17)g比较无显著性差异，(P>0.05)。见图1E。

图1 不同麻醉剂对蟾蜍神经—腓肠肌的影响

2.3 麻醉剂对蟾蜍离体心脏搏动的影响 分别用戊巴比妥钠、氨基甲酸乙酯、异丙酚和MS-222对蟾蜍进行麻醉处理，毁脑脊髓组作为对照，检测不同麻醉剂对蟾蜍离体心脏搏动的影响。

与毁脑脊髓组相比，戊巴比妥钠、氨基甲酸乙酯麻醉处理的蟾蜍，其心脏的EST、EDT和 HR均有显著性降低，且氨基甲酸乙酯处理的蟾蜍其心脏搏动曲线出现明显波动异常，而异丙酚麻醉的蟾蜍其离体心脏的EST和EDT与对照组无显著性差异，但HR明显降低，说明上述三种麻醉剂对蛙心搏动均有不同程度的影响(图2、图3A～C)。而MS-222浸泡法处理的蟾蜍，其离体心脏的EST、EDT和HR与对照组均无明显差异(P>0.05)。说明MS-222对蛙心的搏动无明显影响，故选择MS-222浸泡麻醉组进行后续研究(图2、图3A～C)。

图2 不同麻醉剂处理的蟾蜍离体心脏的心搏曲线

2.4 MS-222对药物处理的蛙心搏动的影响 选择MS-222浸泡处理的蟾蜍作为实验组，毁脑脊髓处理的蟾蜍作为对照组，分离蛙心，分别记录CaCl2、KCl、乙酰胆碱和肾上腺素处理前后蛙心的EST、EDT和HR的变化情况。结果如图3所示，MS-222实验组和对照组的蛙心的EST、EDT和HR变化趋势均完全一致，无明显差异(P>0.05)。见图3D～F。

图3 不同麻醉剂对蟾蜍离体心脏的影响

3 讨论

不同麻醉剂对不同的组织、系统等影响不同[6-12]，且麻醉剂腹腔麻醉后对蟾蜍坐骨神经—骨骼肌和离体心脏是否受到影响或影响程度大小尚无报道。本实验研究发现，戊巴比妥钠和氨基甲酸乙酯麻醉处理的蟾蜍，其腓肠肌和心脏收缩均受到明显抑制，说明两种麻醉剂均不适合作为神经—腓肠肌和蛙心实验的制动方法。

异丙酚是目前最新的静脉麻醉药，已被广泛应用于临床麻醉和ICU镇静。已有文献报道异丙酚可显著抑制大鼠心肌收缩[13]，但其对蟾蜍骨骼肌和心脏的影响尚无研究报道。本研究发现，异丙酚麻醉法对蟾蜍心脏搏动有影响，但用异丙酚麻醉的蟾蜍其腓肠肌收缩的各项指标及变化趋势均与毁脑脊髓组无显著性差异，说明异丙酚对坐骨神经—腓肠肌的兴奋与收缩无影响或影响不明显。故异丙酚可作为替代法用于神经—腓肠肌实验中的蟾蜍制动处理。

MS-222，(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate)，俗称鱼安定等，是美国FDA批准的唯一活鱼运输麻醉剂[14]。MS-222还用于各种水产品的实验室研究领域，已被用于多种实验用鱼或两栖动物的麻醉[2,5,15-16]。但该麻醉剂用于中华蟾蜍的研究鲜有报道，同时MS-222对神经—腓肠肌和离体心脏的影响更无研究。本研究发现，1% 的MS-222浸泡处理的蟾蜍，其腓肠肌收缩力明显减弱，但心脏搏动(EST、EDT、HR)与毁脑脊髓处理组无显著性差异，说明MS-222对心脏没有影响或影响极小，故MS-222可作为蟾蜍心脏实验的麻醉剂。

用MS-222浸泡法和异丙酚腹腔注射法处理蟾蜍，有以下几个优势：(1)人道主义，善待动物，该方法可最大限度地减少实验动物——蟾蜍的痛苦，异丙酚麻醉后的蟾蜍5min之内即可进入麻醉状态，用1% MS-222浸泡处理的蟾蜍10～15min即可麻醉；(2)操作简单，在实验教学中，学生更易掌握，保证实验的顺利进行；(3)安全角度，该方法可最大限度地避免和减少由于操作不当而造成的意外，保证学生的人身安全；(4)增强学生动物福利方面的意识，加强动物伦理方面的教育，有助于学生医德的培养。

总之，本研究以医学教学实验中常用的实验动物蟾蜍为研究对象，首次就多种麻醉剂在经典生理实验——神经—腓肠肌兴奋收缩实验和离体蛙心实验中的影响进行充分探讨，首次确定了异丙酚腹腔麻醉和MS-222浸泡麻醉法分别对神经—腓肠肌和心脏不产生明显影响，并首次确定了二者可作为神经—腓肠肌实验和心脏实验的毁脑脊髓固定法的替代方法，该方法简单易行，对操作技术要求低，同时避免对蟾蜍的过度伤害，可广泛用于今后的教学和科研实验。