大麦若叶青汁粉总三萜超声提取工艺研究

陈 琼，许雪华，蒋变玲

(宿州学院 生物与食品工程学院，宿州 234000)

大麦属一年生禾本科植物，而大麦若叶是生长到15 ～ 30 cm的大麦嫩叶[1].大麦若叶保健品起源于1960～1970年，一位日本医学博士(荻原义秀)饮用麦苗汁一定时间后，因汞中毒而严重受损的身体恢复了健康，随后发表相关论文，并促进大麦苗汁保健品的商业化[2].进入21世纪后，伴随麦绿素系列保健品迅速风靡美国、香港、新加坡等地，而对大麦苗的研究成为新的热点[2-3].王晓洁等[4]、Panthi Mamata等[5]的研究表明，大麦苗不但具有抗氧化、稳定红细胞膜、抗疲劳、提高机体免疫力和增强耐力的作用，而且具有显著的消炎作用.张秋英等[6]通过临床观察表明，麦苗粉可改善寝息和记忆、促进伤愈、缓解不适、促进排毒和延缓衰老等功效.王炜等[1]推断，大麦苗的功效可能与其抗氧化酶类、叶绿素、黄酮类等活性物质有关.此外，大麦苗中的各类丰富的营养素和膳食纤维[1]以及其他功能性成分如多酚[6]、γ-氨基丁酸[7]等受到较多关注，但尚缺乏关于大麦若叶中总三萜的报道.

三萜类化合物还具有抗菌抗炎、抑制肿瘤、调节血糖、防治心血管疾病等诸多功能[8].对于天然物质中活性成分总三萜化合物成分的提取，国内外已有较多的方法，目前常采用以下提取方法：传统浸提法(包括回流提取法、浸提法和水煮醇沉法)[9]，该方法耗时，有效成分易受破坏，且提取效率有限[10]；超临界CO2提取[11]，该方法价格昂贵，运行消耗较大，清洗维护困难，生产成本高，难以产业化生产[12]；实际应用中，微波提取法[13]不能用于热敏感性物质的提取[14]；超声波提取法[15]可加速有效成分溶出，缩短提取时间并提高提取率，亦免去高温对提取成分的影响[16].本研究采取超声助提的方式提取大麦若叶青汁粉中的总三萜，并运用响应面软件优化大麦若叶青汁粉总三萜提取条件.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大麦若叶青汁粉(随州市万松堂康汇有限公司)；香草醛(分析纯)(国药集团化学试剂有限公司)；熊果酸(≥98%)(库尔化学科技(北京)有限公司).

722N紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；KQ5200DE超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；FA-N精密电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；H1850台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司).

1.2 试验方法

1.2.1 总三萜含量测定

总三萜含量测定参照刘奇等[17]的研究方法，略有改进.

标准曲线的绘制：配制0.18 mg/mL的熊果酸标准品母液.分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL标准品母液于试管中，用沸水浴挥干溶剂后，依次加入0.2 mL香草醛-冰乙酸(5%，现配)及0.8 mL的HClO4，迅速振荡混匀，70 ℃水浴15 min后冷水浴冷却至室温.加入5 mL的冰乙酸摇匀，避光处反应30 min.空白以乙醇代替熊果酸标液，于546 nm处测定吸光度.以吸光度值为Y轴，熊果酸质量为X轴，绘制标准曲线.所得标准曲线为y=8.6889x-0.0046，R2= 0.9913.

大麦若叶青汁粉中总三萜的测定：将单因素试验的提取液于3 500 r/min下离心15 min，上清液为待测液.吸取0.2 mL待测液，沸水浴挥干溶剂.后续操作如标准曲线的绘制，计算大麦若叶青汁粉中总三萜的得率，公式如下:

式中：X为所得标曲中大麦若叶青汁粉总三萜的质量/mg；V为超声溶剂体积/mL；M为大麦若叶青汁粉质量/g；n表示稀释倍数.

1.2.2 单因素试验

精确称取1.00 g大麦若叶青汁粉，提取工艺条件见表1，分别考察乙醇浓度、液料比、超声时间和功率对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响.

表1 单因素试验

1.2.3 响应面法优化试验设计

因提取功率在80 W后对总三萜提取率的影响不显著，故不作为响应面法优化的考虑因素.根据单因素实验结果，确定因素为乙醇浓度、液料比和超声时间，因素代码分别为A、B、C，选取相应因素下总三萜提取率较高的3个水平(-1、0、1，分别代表最大值左侧值、最大值、最大值右侧值).运用Design-Expert 8.06软件，选取Box-Benhnken中心组合实验设计原理，以总三萜提取率为响应值，对提取条件进行优化，响应面法优化试验设计见表2.

表2 响应面分析因素和水平

1.2.4 数据分析

所有测定均进行3次平行试验，结果表示为平均值±标准差，采用SPSS 20.0进行Duncan’s差异性分析(P<0.05)和单样本t检验，运用软件Design-Expert 8.06进行响应面分析.

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响

运用SPSS软件统计分析的结果如图1，图中5个点是5组数据的平均值. 运用SPSS对这5组数据进行两两比较以分析数据之间有没有统计学上的差异，用字母a～d表示总三萜得率从高到低，同一字母表示组之间无显著差异，不同字母代表差异显著(P<0.05)(以下所有图同).

图1 乙醇体积分数对总三萜得率的影响

由图1可知，当浓度在50%～60%时，总三萜得率骤增；而在60%～80%时，总三萜得率平稳递增.当浓度在80%～90%区间时，总三萜得率随乙醇浓度的增加反而降低.推测其原因可能是：当乙醇体积分数大于80%时，蛋白凝固产生传质阻力，阻碍青汁粉中三萜的提取[18]；或者大麦若叶中三萜为弱极性物质，与80%乙醇极性相似，随乙醇浓度增加，溶剂极性改变而溶解度降低[19]；抑或乙醇浓度过大导致多糖、蛋白质等大分子物质产生凝聚和阻滞，堵塞组织微孔，致使三萜扩散阻力增加[20].而且乙醇浓度过高会造成成本不必要的消耗，所以，最佳乙醇浓度是80%.

2.1.2 液料比对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响

液料比对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响如图2，图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05).

图2 液料比对总三萜得率的影响

由图2可得，在液料比10∶1 ～ 20∶1之间，提取率随液料比增加而增加，原因为液料比增加，三萜酸类在物料和溶剂之前浓度差增加，有利于传质作用[21]，且不利于超声空化作用[17].在液料比为20∶1时三萜提取率达到峰值，随后料液比增加，提取率下降.推测物料中的三萜含量有限，随液料比增加，在相同时间内体系升温较慢，从而影响提取[22].因此，最佳液料比为20∶1.

2.1.3 超声时间对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响

超声时间对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响如图3.由图3可知，在超声20 min时，大麦若叶青汁粉总三萜得率达到峰值.推测超声时间过短，大麦若叶青汁粉中的三萜物质还没有完全从物料中溶解扩散到溶剂中；而在超声时间超过20 min后三萜得率显著下降，推测物料在持续超声作用下，机械剪切力会破坏溶出的三萜类物质，使得三萜得率下降，并且会引起其他醇溶性物质的析出，与三萜竞争溶剂，从而使总三萜的提取率下降[22].所以20 min为最佳超声提取时间.

图3 超声时间对总三萜得率的影响

2.1.4 超声功率对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响

超声功率对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响如图4.

图4 超声功率对总三萜得率的影响

由图4可见，总三萜得率在功率60～80 W之间时随功率增加呈折线式上升.推测增强的超声功率使大麦若叶细胞壁破碎增加，致使三萜提取率增加.当超声功率为80 W时，得率最大，而后变化不显著.因此最佳超声功率为80 W.超声功率过大，加快的溶液分子运动可能破坏三萜结构[17].

2.2 响应面法优化提取工艺

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

根据单因素试验结果，设定因素代码A、B、C以及选取3个水平(-1、0、1)，通过Box-Benhnken中心组合实验设计，得到17组试验方案，并据此进行提取分析，相关数据如表3.

2.2.2 模型的建立以及方差分析

根据试验数据建立大麦若叶青汁粉总三萜提取得率与3个因素间的反应关系，用R表示青汁粉总三萜的提取得率所得方程式为：

R= 21.92-0.18A+3.31B+0.68C+1.08AB-1.15AC+4.09BC-2.08A2-5.16B2-4.81C2.回归系数方差分析见表4.

由方差分析看出，A2对三萜得率影响显著(P<0.05)，B、BC、B2、C2对总三萜得率影响为极显著(P<0.01).由F检验得，各因素影响大小顺序为：液料比> 超声时间>乙醇体积分数%.模型的F值为28.29且P=0.0001(<0.01)，相关系数R2=0.9732，说明该模型拟合效果极显著，该模型有效，模型预测值和三萜提取率试验值具有良好的一致性.失拟项P值为0.0910(>0.05)，失拟不显著，说明实际值和模型预测值不拟合的概率较小.而信噪比为16.967，远大于4，说明该模型适合指导工艺优化.综上，该方程的拟合度很好，可以用于优化和预测大麦若叶青汁粉总三萜提取最佳工艺.

2.2.3 响应曲面分析

通过Box-Behnken试验得到的二次回归模型所作的响应面图及等高线如图5-图7，可用于评价各因素间交互作用对大麦若叶青汁粉总三萜提取得率的影响，并且确定各因素的最佳水平范围.响应曲面坡度平缓，等高线呈圆形，则说明二者的相互作用弱，反之则强[22].由表3可见，液料比和超声时间之间交互作用显著，可由图7直观反映出.

表3 试验设计与结果

表4 回归方程系数方差分析表

图5 乙醇体积分数和液料比交互作用的响应曲面图和等高线图

图6 超声时间和乙醇体积分数交互作用的响应曲面图和等高线图

图7 超声时间和液料比交互作用的响应曲面图和等高线图

2.3 最佳提取工艺的验证

根据模型分析可知，大麦若叶青汁粉总三萜提取的最佳条件是：乙醇79.97 %，超声22.50 min，液料比为24.20∶1，大麦若叶青汁粉总三萜预测值为22.70 mg/g.考虑到现实操作的限制，将乙醇体积分数修正为80%，液料比为24∶1，超声时间选择22 min，超声功率定为80 W.按照修整后条件进行提取，总三萜得率为21.69 mg/g，将实测值与理论预测值进行单样本t检验，结果见表4.

系统计算分析得出t为-1.572，双侧Sig.值0.257>0.05，实测值和理论值之间不存在显著差异，说明响应面可以很好地预测大麦若叶青汁粉中总三萜得率.

表5 三萜得率与预测值的单样本t检验

3 结论

以大麦若叶青汁粉为试验原料，用超声波辅助提取大麦若叶青汁粉中的总三萜，考虑多个因素对大麦若叶青汁粉总三萜含量的影响，再以此为数据基础，用响应面软件进行优化，预测最优提取工艺，最终获得的提取条件为：液料比为24∶1 (mL/g)，超声22 min，乙醇80%，实测总三萜得率为21.69 mg/g.同时，超声提取相比传统提取方法在成本消耗、环境污染、提取时间、设备维护、有效成分的含量等上面均有着较多优势.超声助提与响应面法的结合，很大程度上促进了大麦若叶青汁粉总三萜的浸出率，为其开发利用提供依据和基础.