一种耐热亚硝化单胞菌富集培养物的特性及其在污水中的脱氨效果

许 慧， 高慧娟， 蔡雨衡， 苏可欣， 刘浩杰， 程 凯

(湖北工业大学资源与环境工程学院/河湖生态修复与藻类利用湖北省重点实验室， 武汉 430068)

自养氨氧化细菌(Autotrophic ammonia oxidizing bacteria，AOB)通过将氨氮转化为亚硝氮，在氮循环中起重要作用[1-2].但由于AOB生长缓慢，代时长达8～14 h[3-10]，且受外界环境影响较大，因此氨氧化被认为是硝化反应的限速步骤[1-2].尽管AOB在绝大多数污水处理设施中的脱氮能力微弱，但其氨氧化能力突出，所积累的亚硝氮更是实施新型生物脱氮工艺(如厌氧氨氧化和短程反硝化等)的必要前提.

温度是影响AOB代谢的重要的因素，多数AOB的适宜温度不高于35 ℃[11-16]，仅有少量报道指出在温泉、堆肥和原油中存在能适应高温的AOB[17-20]：Chikako和Elena分别从堆肥和温泉中获得了能够在50 ℃和55 ℃生长的AOB富集物[17-18]；Hui等也发现55～75 ℃的地下原油中所具有的氨氧化活性与耐热AOB有关[20].但迄今为止，对耐热AOB纯菌种的报道仅有2例：Jones等在河口分离得到了一株AOB，其在40 ℃时的氨氧化活性最高[21]；Yoshikane等人则从热电厂活性污泥中分离得到了一株在48 ℃仍具有氨氧化活性的AOB[22].

目前国内对于耐热AOB的研究还很少，仅王艳等人“初步”鉴定了一株在50 ℃固体培养条件下生长的AOB，但该菌在液体培养基中的氨氧化活性非常微弱[23].显然，高温条件下的活性不稳定是导致难以分离耐热AOB的主要原因[22].考虑到印染等行业和低纬度地区夏季均存在高温污水脱氨的需求[13]，因此值得深入研究在高温条件下具有稳定氨氧化活性且生长较快的AOB.

本文分离得到了一种在高温条件下性状稳定的AOB富集物，研究了其最适生长温度，测试了其在不同温度下对不同污水的氨氧化效果，为该类型AOB的深入理论研究和实际工程应用奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

培养基参考Bollmann和Koops等的方法配制[24-25]，为无机自养培养基，其固体培养基为另加0.9%的琼脂糖，在121 ℃湿热灭菌20 min后备用.

1.2 富集培养和分离纯化

生活污水采自湖北大学，按1%的比例接种于培养基中，27 ℃，160 r·min-1摇床振荡培养.每7 d检测亚硝氮积累情况，将阳性培养液按1%转接至培养基中继续培养，连续3轮.再将阳性富集液涂布平板，27 ℃培养，由于AOB(属于自养微生物)生长缓慢，需培养20 d后挑取单菌落进行振荡扩培.

1.3 PCR与测序

使用HiPure Soil DNA Kit B试剂盒提取样品DNA，使用Qubit® dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度.16S rDNA的V3-V4 区的PCR扩增采用上游引物5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′和下游引物5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′[26].反应体系25 μL：TransStart Buffer 2.5 μL，dNTP混合液2 μL，上下游引物各1 μL，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板2 μL，超纯水16 μL.反应条件为94 ℃预变性3 min，94 °C变性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，72℃最终延伸5 min，24个循环.PCR产物由江苏金唯智生物科技有限公司高通量测序.

amoA基因的PCR扩增采用的引物为amoA-1F-GGGGTTTCTACTGGTGGT和amoA-2R-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC[27].反应体系50 μL：2×San Taq PCR Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板4 μL，超纯水17 μL.反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35循环.PCR产物由生工生物工程(上海)有限公司测序.

上述测序结果经NCBI数据库 Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对后，再采用MEGA5.1的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树.

1.4 温度对富集培养物生长的影响

1.4.1 在培养基中的测试 将菌液按5%的体积比接入100 mL培养基中，于39 ℃，160 r·min-1摇床培养，每24 h取样1 mL测定亚硝氮浓度，当亚硝氮积累速度达到50～100 mg·L-1·d-1时，将其作为接种液.将接种液按3%的体积比接种至1 300 mL培养基中后，再将其分装至250 mL锥形瓶中(每瓶100 mL)，分别在34 ℃、37 ℃、40 ℃和43 ℃条件下，160 r·min-1摇床培养，每24 h取样1 mL测定亚硝氮浓度(ρ，mg·L-1)，并据此计算比生长速度(μ，h-1)和代时(T，h)[3，11]：μ=(lnvn-lnvn-1)/24，其中vn为亚硝氮积累速度(mg·L-1·h-1)，其计算方法为vn=(ρt-ρt-1)/24；T=ln2/μ.

1.4.2 在垃圾渗滤液中的测试 污水为来自湖南某垃圾填埋场的垃圾渗滤液，其氨氮浓度约为400 mg·L-1.将前述1.4.1中的接种液按2%的体积比接种至1 000 mL垃圾渗滤液中，再将其分装至250 mL锥形瓶中(每瓶100 mL)，分别在37 ℃、40 ℃和43 ℃条件下，160 r·min-1摇床培养，每12 h取样测定亚硝氮浓度，对照组不接菌.

1.5 盐度对脱氨活性的影响

向5个500 mL的锥形瓶各分装300 mL无NaCl的培养基，分别加0.75 g，1.5 g，3 g，6 g和12 g的NaCl(盐度分别为0.25%，0.5%，1%，2%，4%)，再用1 mol·L-1的盐酸/碳酸氢钠溶液调节pH至7.8.将调好pH的培养基分装至250 mL锥形瓶中(每瓶100 mL)，按1%体积比接种菌液，27 ℃，160 r·min-1摇床培养至48 h取样1 mL测氨氮，并计算相对脱氨效率(以脱氨量最大组的相对脱氨效率计为100%).

1.6 亚硝氮浓度对脱氨活性的影响

1.7 在低氨地表水中的脱氨效果

地表水来源为武汉市芦湾湖(富营养化湖泊)、武泰闸(黑臭河道)和南湖港(富营养化河道)，向100 mL各来源的地表水接种对数期的SN-6使其初始氨氮去除速率达到约0.1 mg·L-1·h-1，对照组不接菌，150 r·min-1摇床培养，为了有效模拟地表水的实际情况，将培养温度设为27 ℃，每天测氨氮和亚硝氮浓度.

1.8 数据分析方法

氨氮的测量使用纳氏试剂分光光度法[28]，亚硝氮的测量使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[28]；所有试验均设三平行，用Origin 2017 作图，图中的误差量均用SE表示；用SPSS 24进行方差分析(多重比较采用LSD法)，对于部分不服从正态分布或方差齐性的数据，经对数或者平方转化后再进行方差分析.

2 结果与分析

2.1 富集物中的AOB种属

经16S rDNA高通量测序，发现本富集物中仅含一种AOB，其在总菌中的丰度为75%，其16S rDNA序列(Genbank序列号为MN396244，其进化树见图1a)与Nitrosomonasnitrosa Nm 90的同源性最高(Identity为100%)，故命名为N.nitrosaSN-6.类似的，其amoA基因序列(Genbank序列号为MN397165，其进化树见图1b)与N.nitrosaNm 90的同源性也高达100%.

图1 基于部分16S rDNA序列(a)和amoA基因序列(b)的N. nitrosa SN-6的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of N. nitrosa SN-6 based on its partial 16S rDNA (a) and amoA gene (b) sequence

2.2 温度对生长的影响

在培养基中，如图2(a)，37 ℃和40 ℃更有利于亚硝氮的积累.方差分析也表明，温度对亚硝氮浓度有显著性影响(P<0.05)：48 h时，40 ℃的亚硝氮浓度显著高于34 ℃、37 ℃和43 ℃(P<0.05)；72 h时，40 ℃的亚硝氮浓度显著高于34 ℃和43 ℃，37 ℃的亚硝氮浓度也显著高于43 ℃(P<0.05).此外，各温度组的最大比生长速率和最短代时均出现在24 h～48 h，如图2(b)，且43℃的最短代时明显比34 ℃、37 ℃和40 ℃更长，说明最适生长温度为34 ℃～40 ℃，方差分析也表明，温度对能够显著影响最大比增长速率和最短代时(P<0.05).

图2 不同温度条件下培养基中的亚硝氮积累情况(a)及最大比生长速度和最短代时(b)Fig.2 The accumulation of (a) and the maximum specific growth rate and the minimum generation time (b) at different temperatures in media

当处理垃圾渗滤液时，各对照组几乎不积累亚硝氮，而各试验组不但亚硝氮积累明显，而且氨氮降幅高于对照组，pH也显著低于对照组(P<0.05)，均说明富集培养物是试验组氨氧化的主要原因(图3).特别是，至24 h，40 ℃实验组的亚硝氮积累量和氨氮去除量均为最高，pH则最低(P<0.05)，均说明40 ℃为最适氨氧化温度，这与培养基中测试的结果是一致的.此外，根据亚硝氮积累量计算了各温度下的代时，也发现40 ℃时的代时(5.9±0.1 h) 与37 ℃(6.5±1.6 h)无显著差异(P>0.05)，但显著小于43 ℃(6.6±0.2 h)(P<0.05)，而，说明SN-6在垃圾渗滤液中的最适生长温度为37 ℃～40 ℃，这也与培养基中获得的结果基本吻合.

2.3 盐度耐受性

由图4可见，盐度对脱氨活性有显著性影响(P<0.05).其中盐度0.5%时的相对脱氨效率最高(P<0.05，其氨氮降幅为52 mg·L-1)，而脱氨活性的最适盐度为0.5%，半数抑制盐度略高于1%，而最大耐受盐度则大于4%.

图4 不同盐度下的相对脱氨效率Fig.4 Relative removal efficiency of ammonia nitrogen at different salinities

2.4 亚硝氮耐受性

由图5可见，无亚硝氮组的相对脱氨效率最高(P<0.05，其氨氮降幅为108 mg·L-1)，脱氨活性的半数抑制亚硝氮浓度约为850 mg·L-1，完全抑制亚硝氮浓度则约为2 200 mg·L-1.

图5 不同亚硝氮浓度下的相对脱氨效率Fig.5 Relative removal efficiency of ammonia nitrogen at different nitrite concentrations

2.5 在不同类型的低氨地表水中的脱氨效果

由图6a可见，武汉市芦湾湖、武泰闸和南湖港地表水中的氨氮浓度分别为5.0、15.4和22.6 mg·L-1，经SN-6在27 ℃处理3 d后的氨氮去除速率分别可达98%、93%和98%，均明显高于各对照组(均小于2%，P<0.05)，说明SN-6能够使污染地表水中的氨氮浓度从Ⅴ类/劣V类标准迅速提升至Ⅱ类.此外，试验期间的亚硝氮积累量与氨氮去除量基本相当，如图6，说明氨氧化是SN-6在低氨地表水中的主要脱氨方式.

图6 在不同类型低氨地表水中的脱氨效果(a)和亚硝氮积累效果(b)Fig.6 NH3-N removal effect (a) and accumulation effect (b) in different types of low-NH3-N ground water

3 讨论

由于N.nitrosaSN-6与N.nitrosaNm 90的16S rDNA序列及amoA基因序列的相似度均高达100%，考虑到N.nitrosaNm 90与已知的耐热AOB纯菌株Nitrosomonassp. JPCCT2的16S rDNA序列的相似度也为100%[22]，说明N.nitrosaSN-6与耐热的Nitrosomonassp. JPCCT2的进化关系较近.

从氨氧化活性上看(表1)，以往报道的耐热AOB及其富集培养物的耐热范围为45 ℃～60 ℃，氨氮去除速率为1.2 mg·L-1·d-1～19.78 mg·L-1·d-1，而本文的AOB富集物的耐热上限至少达到了43 ℃，且在37 ℃～40℃时能够达到129 mg·L-1·d-1的最大亚硝氮积累速率，明显高于以往的报道.

表1 不同耐热亚硝化单胞菌在培养基中的氨氧化活性和生长的比较Tab.1 Comparison of ammonia-oxidizing activity and growth of different heat-resistant Nitrosomonas strains in culture media

相较于对氨氧化活性的研究，前人对耐热AOB生长的研究则更少(表1)：Nitrosomonassp. JPCCT2的耐高温上限虽高达48 ℃，但其最适生长温度仅为28 ℃，且在高温下的生长极其缓慢(如其在37 ℃时的最短代时长达7.5 d)[22].相比之下，本研究AOB富集物在37 ℃时的最大比增长速度为2.73 d-1，最短代时低至约6.1 h，说明本AOB富集物在高温条件下的生长速度更快.

此外，即便是与常温型的AOB相比，本富集培养物的代时也更短.如Nitrosomonasmobilis[3]在27 ℃的代时为10～14 h，Nitrosovibrioeuropaea[4]在27 ℃的代时为10～14 h，Nitrosospira[4]在27 ℃的代时为20～21 h，而Nitrosovibriotenuis[5]在25 ℃～30 ℃的代时为12～13 h，N.eutrophaCZ-4[10]在31 ℃的代时为8.2 h.而本AOB富集物在培养基中，34 ℃～40 ℃区间的最短代时均小于7.5 h；在垃圾渗滤液中，37 ℃～43 ℃区间的最短代时也均小于7 h，都明显比已知的AOB[3-10]生长更快.

本富集培养物脱氨活性的半数抑制盐度略高于1%，最大耐受盐度则大于4%.相比之下，N.europaea19718[25]的最大耐受盐度为2.3%，N.mobilisMs1[3]和Nitrosomonassp. JPCCT2[22]的半数抑制盐度分别为1.46%和1.8%.而张宇坤等人对AOB富集培养物的研究也表明，当盐度为0.25%和3%时，氨氧化活性分别下降了6.6%和79.2%[29]，此结果与本文的盐度抑制效应基本相当.

本富集培养物脱氨活性的半数抑制亚硝氮浓度约为850 mg·L-1，完全抑制亚硝氮浓度则约为2 200 mg·L-1.考虑到游离亚硝酸(Free nitrite acid，FNA)是亚硝氮致毒的主要成分[6，30]，相应的半数/完全抑制FNA浓度分别为0.095 mg·L-1和0.243 mg·L-1，高于N.europaea19718[30]、N.eutrophaC91[6]及Nitrosomonassp. AL212[31]的最大FNA耐受浓度，而与N.mobilisMs1[3]及N.eutrophaCZ-4[10]相当，仅略低于N. stercoris KYUHI-S[32].较强的耐盐能力和耐FNA能力将有助于扩展SN-6的应用范围，也可能是该菌在垃圾渗滤液中脱氨效果明显且生长迅速的原因.

在低氨地表水中，接种本富集培养物后，仅需72 h即可使超过22 mg·L-1的氨氮降至低于1.5 mg·L-1.类似的，当采用低氨亲和力较高的N.eutrophaCZ-4处理黑河水时，当其脱氨速度达到0.09 mg·L-1·h-1后，约需42 h使氨氮从14 mg·L-1降至约3 mg·L-1[10]，说明SN-6同样也具有较高的氨亲和力.需要注意是，尽快通常认为氨氧化是硝化过程的限速步骤(而不是亚硝氮氧化)，但也应避免由于过量使用氨氧化菌而导致地表水大量积累的亚硝氮的情况，可以采取的措施包括严格控制氨氧化菌的投加量、辅助投加亚硝氮氧化菌等.

4 结论

本研究获得的耐热AOB富集物中的优势AOB菌种为N.nitrosaSN-6，其最适生长温度为37～40 ℃(最短代时约为6 h)，最高耐受温度不低于43 ℃，既能够在高温垃圾渗滤液中快速生长并脱氨，也能够在3 d内使污染地表水中的氨氮从5～23 mg·L-1降至不超过1.5 mg·L-1.