海南桑树栽培品种桑叶中1-脱氧野尻含量的测定

何际婵 董志超

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南海口 571737)

桑叶为桑科（Moraceae）植物桑（Morus alba L.）的叶，具有疏风清热、平肝明目的功效［1］。现代药理研究表明，桑叶中含有多种羟基生物碱，其中以1-脱氧野尻霉素（DNJ）为代表的多羟基生物碱是桑叶中重要的降血糖成分［2-3］。DNJ 是从桑树中发现的一种天然哌啶生物碱，它可竞争性地抑制小肠粘膜上的ɑ-糖苷酶的活性，减缓葡萄糖的吸收速率，降低餐后血糖浓度，从而发挥治疗糖尿病的作用［4-5］。但桑叶的DNJ 含量受桑树品种、生长环境、桑叶部位等影响较大［6］。任立松等［7］为探明东北地区不同桑树品种间1-脱氧野尻霉素含量的差异，对10 个现行品种叶片中的DNJ含量进行了测定，结果表明不同品种间DNJ 含量存在一定的差异。禚苏等［8］安康地区具有代表性的24 个桑树栽培品种桑叶为原材料，运用反相高效液相色潽法测定各品种春季桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量，结果表明，安康地区桑树品种中桑叶DNJ 含量具有显著差异。

近几年，在“东桑西移”“北桑南移”的结构性区域调整下，海南的蚕桑产业迅速发展［9］，并建立了桑树种质资源圃。

但目前尚未见有关海南种植桑叶品种DNJ含量测定的报道。DNJ 因其结构中缺少发色团，所以很难采用HPLC 法直接测定。目前，桑叶中DNJ 的检测多采用HPLC-ELSD法［10］、HPLC-FLU法［11］、HPLCMS法［12］和柱前衍生化HPLC-UV法［13］等。本研究运用柱前衍生化HPLC-UV 法对海南省目前种植的31个桑树品种桑叶进行DNJ含量测定，为桑叶在海南的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

供试材料为海南创科农旅集团桑树种质资源圃中栽植的海南省主要桑种品种，包括粤桑11号、黑珍珠、日本甜桑、胖果桑、强桑2号、大十、红果2 号、红果5 号、抗青283、桂桑优62、桂桑6号、农桑14号、新西兰垂桑、新西兰九曲龙桑等，共31 个品种。于2020 年6 月，取桑枝顶自下7、8 片叶，于50℃烘干至恒重，将以上样品粉碎后过60目筛，备用。

1.1.2 仪器

Agilent1260 高效液相色谱仪（G1329A 自动控温进样器，G1311A 四元泵，G1316A 柱温箱；美国安捷伦公司）；电子天平（BSA224S—CW；赛多利斯科学仪器有限公司）；高功率数控超声波清洗器（KQ－700DA 型；江苏昆山）；高速冷冻离心机（Thermo Fisfer）；GZX－9240MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.1.3 试剂

1-脱氧野尻霉素标准品（纯度≥98%，10027491），美国麦克林公司；9-氯甲酸芴甲酯（FMOC-CL，纯度＞98%，C10074878），美国麦克林公司；乙腈（色谱纯，178508），德国默克公司；氯化钾、硼酸、氢氧化钠（分析纯，北京化工厂）；水为双重蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

参考郑晓静等［14］的方法，并略有改动。色谱柱：Waters C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1% 醋酸（35∶65，V/V）；流速：1.00 mL/min；柱温： 30 ℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

1.2.2 对照品与供试品溶液的制备

精密称取DNJ 对照品10 mg，用甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，得1.0 mg/mL对照品溶液，置冰箱备用。

精密称取供试桑叶粉0.5 g 于15 mL 离心管中，加入6 mL 50%乙醇水溶液，超声提取30 min（温度50℃，功率200 W）；以5 000 r/min 离心30 min，收集上清液，重复提取3次，合并3次提取液。

1.2.3 DNJ的衍生化

桑叶供试品溶液及DNJ对照品溶液的衍生化反应参照文献［14］。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，依照上述色谱条件测定。以峰面积作为纵坐标，以浓度作为横坐标，进行线性回归，回归方程为：y=47 820.489x+247.586 82 （r=0.994 9，n=5）。结果表明，DNJ 在0.308～12.622 μg 呈现良好的线性关系。HPLC图谱见图1。

2.2 精密度试验

精密吸取同一份供试液，连续进样5次，每次进样10 μL，计算峰面积得RSD=1.08%。

2.3 稳定性实验

取同一份桑叶的供试品溶液，分别在第1、3、5、8、10、12 h 进样，每次进样10 μL，按上述色谱条件测定，测定峰面积，计算得RSD=0.89%（n=6），结果显示，该溶液在12 h内稳定。

2.4 重现性实验

依照供试品溶液制备方法平行制备5 份强桑2号桑叶供试品溶液，分别进样10 μL，测定峰面积，计算得RSD=1.45%（n=5），结果显示，该方法具有较好的重现性。

图1 1-脱氧野尻霉素对照品（A）和样品（B）的HPLC色谱图

2.5 加样回收率实验

称取6份已知含量的强桑2号粉末各0.1 g，分别加入DNJ 对照品溶液，按“1.2.2”方法制备溶液，再按上述色谱条件测定含量，计算回收率。结果得平均回收率为99.5%，RSD=1.90%（n=6），表明本测试方法符合加样回收率的要求，结果见表1。

表1 DNJ的加样回收率

2.6 方法检测限及定量限的确定

方法检测限、定量限是通过所测得色谱峰的信噪比（S/N）来确定。S/N=3 对应的标准溶液浓度为该方法的检测限；S/N=10对应的标准溶液浓度为该方法的定量限。通过柱前衍生化HPLC-UV法测定不断稀释的DNJ标准溶液，得到该方法的检测限和定量限分别为0.23、0.65 μg/mL。

2.7 样品测定

按“1.2.2”方法制备3 份样品，再分别进行样品测定，结果见表2。海南栽培的31个桑树品种中，有3 个桑树品种的DNJ 含量在3.00 mg/g 以上，即强桑2 号、大十、大白珍珠；其中DNJ 含量最高的是强桑2 号，为3.68 mg/g，其次为大十、大白珍珠，分别为3.23、3.15 mg/g；有7 个桑树品种的DNJ 质量分数均在2.00～3.00 mg/g：抗青283、桂桑优62、日本甜桑、胖果桑、强桑3 号、油桑和陕860；有19个桑树品种的DNJ质量分数均在1.00～2.00 mg/g。而黑珍珠桑、桂芒桑、红果5 号等桑叶品种DNJ含量较低，分别为0.62、0.88、0.96 mg/g。

3 讨论

结果表明，不同品种DNJ 含量的变化较大，DNJ 含量3.68～0.62 mg/g，其中强桑2 号中DNJ 含量最高，为3.68 mg/g；黑珍珠桑DNJ 含量最低（0.62 mg/g）；强桑2号中DNJ含量是黑珍珠桑的5.93倍。说明不同桑树品种产生的DNJ 有差异，为选育高DNJ 含量的桑树品种奠定基础。强桑2 号不但DNJ 含量最高，且叶片肥大，可以作为DNJ类的药食产品开发原材料。

郑晓静等［14］用RP-HPLC 方法对桑叶中的DNJ 含量进行了测定，该方法最大的特点是没有加入甘氨酸和0.1%的醋酸终止DNJ 的衍生化反应。从本实验借鉴该方法的精密度、稳定性、重现性及回收率的测定结果来看，只要在12 h 内完成检测，即表明该方法稳定可靠且更简便。

表2 不同品种桑叶中DNJ的含量

本实验考查了酸水、去离子水、稀醇3种溶剂对DNJ 提取率的影响，结果表明稀醇提取的DNJ 含量最高，最终选择稀醇作为提取溶剂。

有文献报道称，DNJ 的日服用有效剂量至少为6 mg，才能起到预防或治疗糖尿病的目的，而桑叶中DNJ 的含量偏低，如何有效提高桑叶中DNJ 的含量将是未来一段时间内桑叶研究的方向之一。