阿法替尼增强耐药性卵巢癌细胞对多柔比星化疗敏感性的机制研究

余娟娟，贾瑞诺，周小燕，田晓予#

河南科技大学第一附属医院1妇产科，2肿瘤内科，河南 洛阳 471000

卵巢癌是一种妇科恶性肿瘤，其发生可能与复杂的卵巢胚胎发育、组织解剖学和内分泌功能密切相关，卵巢癌发病隐匿，早期症状不明显。化疗是预防卵巢癌患者术后复发和转移的方法，但肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是化疗失败的重要原因。因此，卵巢癌化疗增敏剂的筛选和开发具有重要的临床意义。多柔比星是广谱蒽环类抗肿瘤药物，在临床中广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌和白血病。筛选化疗增敏剂以提高多柔比星化疗的疗效并逆转其多药耐药性，是肿瘤学领域的研究热点之一。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的异常表达与各种恶性肿瘤的发生发展密切相关。阿法替尼是第一个不可逆的靶向EGFR及HER2双受体起效的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）类药物。但是阿法替尼联合常用的化疗药物多柔比星对卵巢癌细胞生长的影响尚未见报道。本研究通过分析阿法替尼对卵巢癌耐药细胞株A2780T体外增殖的影响，探讨阿法替尼增强耐药性卵巢癌细胞对多柔比星化疗敏感性的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人卵巢癌耐药细胞株A2780T购自南京凯基生物科技有限公司。

1.2 试剂

阿法替尼（纯度＞98%）和多柔比星（纯度＞98%）均购自大连美伦生物技术有限公司；RPMI1640、DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司；双抗体溶液购自杭州吉诺生物医学技术有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒购自上海臻科生物科技有限公司，三磷酸腺苷结合盒转运子B亚家族成员1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）特异性干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉玛生物技术有限公司合成；ABCB1-GloTM Assay Systemsi试剂盒购自美国Promega公司；ABCB1抗体购自上海群己生物科技有限公司；EGFR、磷酸化EGFR（phosphorylated-EGFR，p-EGFR）、HER2、磷酸化 HER2（phosphorylated-HER2，p-HER2）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国Bioworld公司。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT 法检测细胞增殖 收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×10/ml，将其接种于96孔板中，每孔100 μl，即5000/孔，培养24 h后，弃去原始培养基，并向每个孔中加入不同浓度（0、0.63、1.25、2.50、5.00 μmol/L）的阿法替尼溶液。培养48 h后，向每个孔中添加15 μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液。培养4 h后，小心吸出并弃去培养孔中的培养基，向每个孔中加入200 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），然后将微量滴定板置于快速振荡器上振荡5 min。测量每个孔的吸光度值，重复3次。计算不同浓度的阿法替尼对卵巢癌细胞的增殖抑制率。根据各组的增殖抑制率，选择对A2780T细胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼浓度与多柔比星联用，采用Bliss法计算半数抑制浓度。

1.3.2 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白表达情况 采用对A2780T细胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼浓度联合多柔比星或单独多柔比星处理A2780T细胞，48 h后应用裂解液裂解，然后将裂解液转移到离心管中高速离心，取上清液，通过BCA法测定上清液的蛋白浓度，调节蛋白浓度后，加入四分之一上清液体积的5×loading buffer，沸水煮5 min后获得总蛋白样品。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离总蛋白，每条泳道上样20 μl，转膜封闭，一抗孵育4℃过夜，TBST溶液洗膜10 min，共3次，孵育二抗1 h。TBST溶液洗膜10 min，共3次，采用电化学发光试剂盒进行显色，曝光。以GAPDH为内参，计算EGFR、p-EGFR、HER2、p-HER2及ABCB1的相对表达量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 阿法替尼对A2780T 细胞增殖的影响

不同浓度（0.63、1.25、2.50、5.00 μmol/L）阿法替尼处理的A2780T细胞的增殖抑制率比较，差异有统计学意义（F=114.584，P＜0.01）。其中，1.25、2.50、5.00 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞的增殖抑制率均高于0.63 μmol/L阿法替尼处理的A2780T 细胞，2.50、5.00 μmol/L 阿法替尼处理的A2780T细胞的增殖抑制率均高于1.25 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞，5.00 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞的增殖抑制率高于2.50 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表1）

表1 不同浓度阿法替尼处理的A2780T细胞增殖抑制率的比较（±s）

2.2 不同组别A2780T 细胞半数抑制浓度的比较

选择对A2780T细胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼浓度与多柔比星联用。分别将多柔比星、多柔比星+0.63 μmol/L阿法替尼、多柔比星+1.25 μmol/L阿法替尼、多柔比星+2.50 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞作为多柔比星组、A组、B组、C组。多柔比星组、A组、B组、C组A2780T细胞的半数抑制浓度比较，差异有统计学意义（

F

=88.382，

P

＜0.01）。A组、B组、C组A2780T细胞的半数抑制浓度均低于多柔比星组，B组、C组A2780T细胞的半数抑制浓度均低于A组，C组A2780T细胞的半数抑制浓度低于B组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同组别A2780T细胞半数抑制浓度的比较（±s）

2.3 不同组别A2780T 细胞中各蛋白相对表达量的比较

多柔比星组、A组、B组、C组A2780T细胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。A组、B组、C组A2780T细胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相对表达量均低于多柔比星组，B组、C组A2780T细胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相对表达量均低于A组，C组A2780T细胞中p-EGFR、p-HER2、ABCB1蛋白的相对表达量均低于B组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同组别A2780T细胞中各蛋白相对表达量的比较（±s）

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统的一种常见恶性肿瘤，病死率居所有妇科肿瘤中的第一位。卵巢癌患者具有非典型的早期症状，多数卵巢癌患者确诊时已发展至晚期，5年生存率仅为25%～30%。卵巢癌易侵袭和转移，且手术难以彻底切除病变，全身化疗是临床中卵巢癌的主要治疗方法。紫杉醇联合铂类药物是晚期卵巢癌患者的一线化疗方法。尽管大多数卵巢癌患者具有良好的初次化疗效果，但是由于传统的化疗药物容易产生耐药性，因此卵巢癌患者往往会在18个月内复发并导致化疗失败，复发性化疗耐药性卵巢癌患者的平均生存期仅为1年左右。此外，化疗失败会导致卵巢癌发生广泛的腹腔和盆腔转移，使晚期卵巢癌患者的生活质量极低。因此，寻找新的卵巢癌化疗药物具有重要的临床意义。

EGFR和HER2的异常表达和激活与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关。阿法替尼是第一个不可逆的TKI，其可以与EGFR的Cys773位点和HER2的Cys805位点共价结合，从而不可逆地抑制这两个关键受体。已有研究报道拉帕替尼和吉非替尼等第一代TKI药物可以增强多药耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性，但尚未报道不可逆TKI药物阿法替尼的类似作用。

本研究结果显示，阿法替尼抑制A2780T细胞增殖呈浓度依赖性，5.00 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞的增殖抑制率最高，选择对A2780T细胞增殖抑制率＜10%的阿法替尼浓度与多柔比星联用，发现多柔比星+2.50 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞的半数抑制浓度低于多柔比星+0.63 μmol/L 阿法替尼和多柔比星+1.25 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。结果表明，高浓度阿法替尼可以作为多柔比星的增敏剂用于卵巢癌的治疗。分析原因是阿法替尼可通过抑制卵巢癌细胞中EGFR和HER2的磷酸化发挥抗肿瘤作用。

研究表明，阿法替尼增强耐药性卵巢癌细胞对多柔比星化疗的敏感性可能通过抑制ABCB1转运蛋白的外排功能来实现。位于细胞膜上的ABCB1是一种能量依赖性药物外排泵，可以通过腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）供给能量，从而将ABCB1转运体底物性化疗药物泵出细胞，使其在肿瘤中的有效浓度降低。多柔比星是ABCB1转运蛋白的底物药物。据报道，ABCB1在结直肠癌、胰腺癌、肾上腺皮质癌和肝癌中高表达，与恶性肿瘤患者的不良预后有关。ABCB1对患者体内底物药物的吸收、分布、代谢和排泄具有重要影响。抑制ABCB1转运蛋白的外排活性将有助于增加具有高表达ABCB1的肿瘤细胞中ABCB1底物性化疗药物积累，从而增加化疗对肿瘤细胞的抑制作用。由于ABCB1转运蛋白及其底物分布广泛，在联合用药中可能发生竞争性或非竞争性药物相互作用，从而影响联合用药的药代动力学过程。本研究结果显示，高浓度阿法替尼联合多柔比星处理的A2780T细胞中ABCB1蛋白相对表达量较低。研究结果证实阿法替尼可以下调ABCB1转运蛋白的表达，进一步突出了阿法替尼靶向ABCB1转运蛋白的优势和潜力，以发挥化疗增敏作用。阿法替尼是靶向EGFR和HER2双重受体的TKI药物，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）途径是EGFR和HER2下游的主要信号转导途径之一。多柔比星+2.50 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞中p-EGFR和p-HER2蛋白的相对表达量均低于多柔比星+0.63 μmol/L阿法替尼、多柔比星+1.25 μmol/L阿法替尼处理的A2780T细胞。分析原因是高浓度阿法替尼可与多柔比星发挥协同作用，有效抑制EGFR和HER2的磷酸化，激活下游PI3K/AKT途径，发挥抗肿瘤作用。这一结果与Hirst等的研究结果一致。

目前已有研究证实阿法替尼能够增敏铂类药物的化疗效果，但阿法替尼联合多柔比星的影响及其对卵巢癌是否具有增殖抑制作用目前尚未见报道。本研究结果显示，阿法替尼可通过抑制p-EGFR、p-HER2蛋白的磷酸化，竞争性抑制ABCB1转运体的功能，发挥抑制卵巢癌细胞体外增殖的作用，增敏化疗药物多柔比星对耐药性卵巢癌细胞A2780T的效果，是一种具有潜力的卵巢癌化疗增敏剂。

综上所述，阿法替尼可增强耐药性卵巢癌细胞A2780T对多柔比星的化疗敏感性，可能与阿法替尼下调p-EGFR、p-HER2和ABCB1蛋白表达有关。