RNA 干扰细胞分裂周期蛋白6基因表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其机制研究

王雁军，王富强，王青兵，沈志玲，韩朋

安阳市肿瘤医院1外科，2实验室，河南 安阳 455000

结直肠癌是全球范围内发病率居第3位、病死率居第2位的恶性肿瘤，据统计，2018年全球共180多万例结直肠癌新发病例和881 000例结直肠癌死亡病例，已经成为全球癌症负担。人一生中患结直肠癌的概率为4%～5%，患病风险与个人特征或习惯有关，如年龄、慢性病史和生活方式。肿瘤的高转移率是结直肠癌治疗的障碍，它由一系列不同的细胞过程组成，如肿瘤细胞局部侵袭周围组织、肿瘤细胞的血管内渗或外渗和远处器官的定植。结直肠癌的发生与多种因素有关，其发病机制复杂，目前主要治疗方法为手术切除病灶、化疗联合放疗等姑息治疗。然而，这些方法都具有局限性。因此，迫切需要了解与结直肠癌转移相关的分子机制，寻找生物标志物，为结直肠癌的诊断和治疗提供理论依据。细胞分裂周期蛋白6（cell division cycle 6，CDC6）是真核细胞中DNA复制的中心调节因子。研究表明，CDC6在结直肠癌中高表达，敲低CDC6的表达可抑制结直肠癌细胞生长、DNA合成、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、细胞迁移和侵袭等恶性行为以及奥沙利铂（oxaliplatin，L-OHP）耐药，而人抗原R（human antigen R，HuR）调控CDC6是驱动结直肠癌发生和L-OHP耐药的重要机制。基于癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的生存分析发现，CDC6低表达与结直肠癌患者预后不良有关，可能成为结直肠癌的预后标志物。CDC6 在宫颈癌、肺腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，提示靶向CDC6是一种很有前途的肿瘤治疗策略。RNA干扰疗法已显示出治疗肿瘤的巨大潜力，如结直肠癌、前列腺癌等。本研究利用RNA干扰技术分析抑制CDC6基因表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响，并探索其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

永生化结直肠细胞株（FHC）和结直肠癌细胞株（SW620、LOVO、HT29）均购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液、噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）均购自美国Sigma公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，β肌动蛋白（β-actin）、CDC6、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、磷酸化-JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化-STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）均购自美国 Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，si-con、si-CDC6均购自上海吉玛制药技术有限公司，异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin VFITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，酶标仪购自德国Eppendorf公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞培养

在RPMI-1640培养基中培养FHC、SW620、LOVO、HT29细胞，其中包含10%的胎牛血清，于5% CO、37℃培养箱中培养，当细胞融合至80%时，采用胰蛋白酶消化，进行接种传代。

1.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测CDC6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达

采用RIPA裂解液提取FHC、SW620、LOVO、HT29细胞总蛋白，用于检测CDC6蛋白表达；采用RIPA裂解液提取转染si-CDC6或si-con的SW620细胞总蛋白，用于检测 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达。提取蛋白后，加入上样缓冲液，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），将其转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，经脱脂奶粉封闭，4℃条件下与相应一抗（CDC6、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗体稀释度均为1∶1000）孵育过夜，Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）漂洗 3次，每次 10 min。室温条件下与二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，置于化学发光液中显色、显影，以β-actin蛋白作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.4 RNA干扰

收集生长状态良好的SW620细胞，以5×10/ml的密度接种于6孔板中，待细胞融合度约为75%时，严格按照Lipofectamine 2000试剂说明书，将si-CDC6转染至SW620细胞（si-CDC6组），其中si-CDC6序列参考陈三三的文献，同时以转染si-con的SW620细胞作为阴性对照（si-con组），转染4～6 h后，更换为含10%胎牛血清的新鲜培养基继续培养。采用Western blot检测si-CDC6组和si-con组SW620细胞中CDC6蛋白的相对表达量，分析转染效果。分析转染CDC6 siRNA对SW620细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。此外，采用JAK2/STAT3信号通路激活剂colivelin处理转染后的SW620细胞（si-CDC6+colivelin组），并检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭情况。

1.5 MTT法检测SW620细胞的增殖情况

调整转染后的SW620细胞密度为5×10/ml，接种于96孔板中，在培养箱中分别培养24、48、72 h，之后每孔加入100 μl MTT溶液（5 mg/ml），培养4 h，弃去孔内液体，加入200 μl二甲基亚砜，振荡孵育10 min充分溶解结晶，酶标仪读取490 nm波长下各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.6 流式细胞术检测SW620细胞的凋亡情况

根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的步骤检测SW620细胞的凋亡情况，收集转染后的SW620细胞1×10个，使用500 μl Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混匀，加入5 μl PI，混匀，避光反应15 min，采用流式细胞仪进行检测。

1.7 Transwell 小室实验检测SW620细胞的侵袭和迁移情况

SW620细胞侵袭能力检测：首先按照1∶5的比例将Matrigel胶和无血清培养基混匀，包被Transwell上室。收集转染后的SW620细胞，于无血清培养基中调整细胞密度为5×10/ml，在上室中加入100 μl细胞，下室中加入含10%胎牛血清的培养基，于37℃、5% CO培养箱中孵育24 h，采用棉签擦除多余的SW620细胞和Matrigel胶，甲醛固定20 min，结晶紫染色20 min，显微镜观察，计数。

SW620细胞迁移能力检测：Transwell上室中不加Matrigel胶，其余步骤同SW620细胞侵袭能力检测。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 不同细胞株中CDC6蛋白相对表达量的比较

永生化结直肠细胞株FHC及结直肠癌细胞株SW620、LOVO、HT29中CDC6蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义（

P

＜0.01）。其中永生化结直肠细胞株FHC中CDC6蛋白的相对表达量低于结直肠癌细胞株SW620、LOVO、HT29，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）（图1、表1）。选择CDC6蛋白相对表达量最高的SW620细胞株进行后续研究。

表1 不同细胞株中CDC6蛋白相对表达量的比较（±s）

图1 Western blot 检测不同细胞株中CDC6蛋白的表达情况

2.2 转染CDC6siRNA对SW620细胞增殖的影响

Western blot检测结果显示，si-CDC6组SW620细胞中CDC6蛋白的相对表达量为（0.31±0.04），低于si-con组的（1.00±0.15），差异有统计学意义（

t

=13.334，

P

＜0.05）（图2），说明转染有效。MTT法检测结果显示，培养 24、48、72 h后，si-CDC6组SW620细胞的OD值均明显低于si-con组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）（表2）。

图2 Western blot 检测不同组别SW620细胞中CDC6蛋白的表达情况

表2 不同组别SW620细胞转染后OD值的比较（±s）

2.3 转染CDC6siRNA对SW620细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，si-CDC6组SW620细胞的凋亡率为（33.12±3.86）%，高于si-con组的（3.27±0.34）%，差异有统计学意义（

t

=23.110，

P

＜0.05）。（图3）

图3 流式细胞术检测不同组别SW620细胞的凋亡情况

2.4 转染CDC6siRNA对SW620细胞侵袭和迁移的影响

Transwell小室实验结果显示，si-CDC6组的侵袭细胞数目和迁移细胞数目均明显少于si-con组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表3）

表3 不同组别SW620细胞中侵袭和迁移细胞数目的比较（±s）

2.5 转染CDC6siRNA对SW620细胞JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，si-CDC6组SW620细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的相对表达量均明显低于si-con组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）；si-CDC6组和si-con组SW620细胞中JAK2、STAT3蛋白的相对表达量比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（图4、表4）

表4 不同组别SW620细胞中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白相对表达量的比较（±s）

图4 Western blot 检测不同组别SW620细胞中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的表达情况

2.6 激活JAK2/STAT3信号通路逆转CDC6siRNA对SW620细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

培养 24、48、72 h后，si-CDC6+colivelin组SW620细胞的OD值均明显高于si-CDC6组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）（表5）。si-CDC6+colivelin组SW620细胞的凋亡率为（7.16±0.73）%，低于si-CDC6组的（35.09±3.24）%，差异有统计学意义（

t

=25.229，

P

＜0.05）（图 5）。si-CDC6+colivelin 组的侵袭细胞数目和迁移细胞数目分别为（36.72±3.96）个和（56.41±5.67）个，分别高于si-CDC6组的（20.13±2.58）个和（29.14±3.05）个，差异均有统计学意义（

t

=10.530、12.707，

P

＜0.05）。

表5 si-CDC6组和si-CDC6+colivelin组SW620细胞转染后OD值的比较（±s）

图5 流式细胞术检测si-CDC6组和si-CDC6+colivelin组SW620细胞的凋亡情况

3 讨论

目前结直肠癌已成为中国第四大常见的恶性肿瘤，也是男性和女性恶性肿瘤相关死亡的第五大和第四大原因。早期检测分子标志物是预防结直肠癌的最有效方法。然而，结直肠癌发生发展的分子机制尚未得到很好的表征。因此，深入了解结直肠癌发生发展中涉及的分子机制，将为结直肠癌的诊断和治疗提供依据。

CDC6是一种多功能分子开关，是DNA复制的重要调控因子，在细胞周期中具有激活和维持检查点机制的重要作用。CDC6也是复制前复合物的一个组成部分，在G早期DNA复制的起点形成，在S期开始参与DNA复制。既往研究表明，CDC6的异常表达在多种人类恶性肿瘤中扮演着重要角色。CDC6在结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、DNA复制、转移、放疗抵抗等过程。Yu等通过分析TCGA数据库，发现CDC6低表达与结直肠癌患者预后不良相关。但多项研究证明，CDC6在肿瘤中过表达，并表明它可能是致癌靶标。例如Kim等研究发现，前列腺癌组织中

CDC6

mRNA的表达水平明显高于前列腺增生组织，且CDC6高表达与临床分期较晚显著相关，CDC6表达可能是前列腺癌侵袭性的新指标。Zhang等研究指出，与正常骨髓单核细胞相比，慢性髓系白血病细胞系K562中CDC6的表达明显上调，小干扰RNA沉默

CDC6

基因表达可有效抑制K562细胞的增殖，促进细胞凋亡，并诱导细胞周期停滞，CDC6过表达可能涉及慢性粒细胞白血病的致癌活性。Deng等探讨了CDC6对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响，结果发现，与正常卵巢组织相比，上皮性卵巢癌组织中CDC6蛋白表达水平升高，下调卵巢癌细胞HO8910中CDC6的表达可抑制细胞增殖和集落形成。本研究中，CDC6在结直肠癌细胞SW620、LOVO、HT29中的表达明显上调，同前述研究结果一致。本研究结果还显示，转染

CDC6

siRNA可显著抑制SW620细胞增殖，诱导细胞凋亡，并降低细胞的侵袭和迁移能力，表现出一定的抗肿瘤活性，与Zhao等的研究结果相符。这些结果提示，CDC6是结直肠癌潜在的预后标志物和治疗靶点。

研究表明，JAK2/STAT3信号通路在肺癌、口腔鳞状细胞癌、甲状腺癌等肿瘤的进展中发挥着重要作用。资料显示，JAK2/STAT3信号通路参与结直肠癌SW620细胞的增殖、迁移和侵袭。JAK2和STAT3磷酸化水平的增加会增强SW620细胞的抗凋亡作用。JAK2/STAT3信号通路的激活需要磷酸化，JAK2/STAT3信号通路的激活与肺癌细胞的生长、迁移和侵袭有关，且可促进肾细胞癌细胞的增殖和迁移并抑制细胞凋亡。本研究中，转染CDC6 siRNA可抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表达，而对JAK2、STAT3蛋白表达无显著影响，表明转染CDC6 siRNA通过降低p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达，抑制JAK2/STAT3信号通路活性。此外，激活JAK2/STAT3信号通路逆转了CDC6 siRNA对SW620细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用，并逆转了其对细胞凋亡的促进作用。这些结果提示抑制JAK2/STAT3信号通路活性可能是转染CDC6 siRNA抗结直肠癌作用的重要途径之一。

综上所述，CDC6在结直肠癌细胞中的表达明显上调，RNA干扰抑制CDC6基因表达后可以抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进其凋亡，调控JAK2/STAT3信号通路活性可能解释了其抗结直肠癌的作用机制，这为结直肠癌提供了一个潜在的治疗靶标。