同源异型盒A5、高迁移率族蛋白1在卵巢癌中表达及临床意义△

乔明静，杨立，路攀，陈雁南

郑州大学第三附属医院妇产科，郑州 450000

卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，其中50%～70%为上皮性卵巢癌，发生于盆腔深部，因早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，病死率较高且预后不良。报道显示，上皮性卵巢癌的发生与环境、生育状况、遗传等多种因素有关，分子水平的研究显示，卵巢癌的发生与癌基因的异常表达、染色体结构变异密切相关。因此，对相关分子进行检测可提早对卵巢癌的诊断、治疗，延长卵巢癌患者生存时间、提高生活质量有重要意义。既往研究显示，同源异型盒（home box，HOX）基因参与细胞的增殖、分化、凋亡的过程，该蛋白异常表达时会使组织、器官结构发生改变，形成肿瘤。HOXA5是HOX基因家族中的一员，其在结直肠癌、乳腺癌、食管癌中异常表达，这可能与肿瘤的侵袭、迁移有关。相关报道发现，高迁移率族蛋白 1（high mobility group box 1，HMGB1）可与DNA结合并改变其螺旋结构，从而影响DNA功能，导致病理生理改变。目前，临床关于HOXA5及HMGB1与卵巢癌的相关报道有限，其在卵巢癌中的作用机制尚不明确。因此，本研究探讨HMGB1与HOXA5在上皮性卵巢癌组织中的表达水平及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月至2019年9月郑州大学第三附属医院收治的上皮性卵巢癌、良性上皮性卵巢肿瘤及无卵巢病变患者（如子宫腺肌病、子宫肌瘤、子宫脱垂等需行全子宫及双附件切除术患者）的临床资料。纳入标准：①年龄≥18岁；②均经病理学检查确诊；③手术前未采取放化疗或生物制剂治疗；④临床资料完整，病理组织完整。排除标准：①合并自身免疫性疾病；②合并其他恶性肿瘤；③妊娠或哺乳期女性。根据纳入和排除标准，本研究共纳入38例上皮性卵巢癌患者、22例良性上皮性卵巢肿瘤患者、20例无卵巢病变患者。上皮性卵巢癌患者年龄20～70岁，平均（54.03±9.75）岁；病理类型：浆液性囊腺癌19例，黏液性囊腺癌13例，子宫内膜样癌4例，其他2例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期17例；淋巴结转移10例，无淋巴结转移28例；组织学分级：G级9例，G级18例，G级11例。良性上皮性卵巢肿瘤患者年龄18～72岁，平均（53.78±9.56）岁。无卵巢病变患者年龄19～71岁，平均（53.24±9.60）岁。三组患者年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。取上皮性卵巢癌患者的卵巢癌组织、良性上皮性卵巢肿瘤患者的良性病变组织、无卵巢病变患者的正常组织，保存待检。

1.2 免疫组化法检测HOXA5、HMGB1蛋白的表达情况

按照免疫组化试剂盒说明书对卵巢癌、良性病变、正常石蜡组织切片，脱蜡、修复，分别采用一抗[Anti-HOXA5抗体（ab82645）、Anti-HMGB1抗体（ab79823）]推荐的浓度稀释后室温孵育1 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗5次，加入二抗，室温下孵育1 h后PBS冲洗5次，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。采用纯化水冲洗终止DAB显色后用苏木素复染，采用1%的盐酸乙醇进行分化，纯化水冲洗10 min，置于60℃烤箱中烤片10 min，最后用中性树胶封片，统一镜检。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 免疫组化法结果判定

HOXA5主要定位于细胞质，细胞质中有明显的棕黄色或黄褐色颗粒为阳性；HMGB1主要定位于细胞核或细胞质，细胞核或细胞质内有棕黄色或黄褐色颗粒为阳性。荧光显微镜下每张切片随机选取5个视野，对细胞染色强度及阳性细胞所占比例进行评分。染色强度：无着色或接近背景色计为0分；浅黄色染色，略深于背景色计为1分；棕黄色染色，明显深于背景色计为2分；棕黄色染色计为3分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞计为0分，阳性细胞所占比例＜10%计为1分，阳性细胞所占比例为10%～50%计为2分，阳性细胞所占比例为51%～75%计为3分，阳性细胞所占比例＞75%计为4分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘，0～2分为阴性（-）、3～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分强阳性（+++）；≥3分判定为阳性，＜3分判定为阴性。苏木素-伊红染色、免疫组化结果均由同一组实验人员或医师进行，结果不一致时由第三方确定。

1.4 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）检 测HOXA5、HMGB1mRNA 的相对表达量

将卵巢癌组织、良性病变组织、正常组织剪碎，依据TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，依据逆转录试剂盒说明书，应用逆转录酶生成cDNA，依据荧光定量PCR试剂盒说明书、RT-PCR法扩增HOXA5、HMGB1目的片段，应用ABI Prism 7300 SDS Software分析HOXA5、HMGB1 mRNA的相对表达量。PCR反应体系，包括1 μl的cDNA，10 μl的 Lpower SYBR green PCR mastermix，1 μl的引物。HMGB1上游引物：5'-GCCTCCTTCGGCCTTCTT-3'，下游引物：5'-ACAGGCCAGGATGTTCTCCTTT-3'；HOXA5 上游引物：5'-AGCCACAAATCAAGGACACA-3'，下游引物：5'-GCTCGCTCACGGAACTATG-3'。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 HOXA5、HMGB1蛋白表达情况的比较

卵巢癌组织、良性病变组织、正常组织中HOXA5、HMGB1蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。进一步两两比较结果显示，良性病变组织和卵巢癌组织中HOXA5蛋白的阳性表达率均低于正常组织，卵巢癌组织中HOXA5蛋白的阳性表达率低于良性病变组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）；卵巢癌组织中HMGB1蛋白的阳性表达率高于良性病变组织和正常组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.05），但良性病变组织与正常组织中HMGB1蛋白的阳性表达率比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。（表1）

表1 不同组织中HOXA5、HMGB1蛋白表达情况的比较[n（%）]

2.2 HOXA5、HMGB1mRNA的相对表达量的比较

卵巢癌组织、良性病变组织、正常组织中

HOXA5

、

HMGB1

mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。进一步两两比较结果显示，良性病变组织和卵巢癌组织中

HOXA5

mRNA的相对表达量均低于正常组织，卵巢癌组织中

HOXA5

mRNA的相对表达量低于良性病变组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）；卵巢癌组织中

HMGB1

mRNA的相对表达量高于良性病变组织和正常组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.05），但良性病变组织与正常组织中

HMGB1

mRNA的相对表达量比较，差异无统计学意义（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同组织中HOXA5、HMGB1 mRNA相对表达量的比较（±s）

2.3 不同临床特征卵巢癌患者卵巢癌组织中HOXA5、HMGB1蛋白表达情况的比较

不同年龄、病理类型、临床分期卵巢癌患者卵巢癌组织中HOXA5、HMGB1蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。不同淋巴结转移情况、组织学分级卵巢癌患者卵巢癌组织中HOXA5蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=12.386、8.464，

P

＜0.05）；不同淋巴结转移情况、组织学分级卵巢癌患者卵巢癌组织中HMGB1蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（

χ

=5.529、9.148，

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同临床特征卵巢癌患者卵巢癌组织中HOXA5、HMGB1蛋白表达情况（n=38）

2.4 HOXA5、HMGB1表达情况的相关性分析

Pearson相关性分析显示，卵巢癌组织中，HMGB1表达与HOXA5表达呈负相关（

r

=-0.371，

P

＜0.05）。

3 讨论

HOX

基因由6个氨基酸组成，属于高度保守的DNA结构域，该基因与早期胚胎发育密切相关。对乳腺癌发病机制的研究发现，

HOX

基因家族成员

HOXA5

可与p53启动子结合，从而激活p53信号通路，诱导细胞凋亡。研究显示，除p53信号通路外，HOXA5还可通过其他途径如caspase 2、caspase 8及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）相关途径等诱导细胞凋亡。细胞凋亡是由基因控制的自主性的程序性死亡，主要作用是清除机体内受损、多余或有害的细胞，同时对周围其他细胞或组织无影响。既往研究显示，肿瘤的发生可能与细胞凋亡不足有关，细胞生存期的延长，可导致突变或危险的细胞大量生长积聚，最终形成肿瘤。黎超莲等研究显示，卵巢癌组织HOXA5蛋白的相对表达量明显低于正常输卵管和卵巢组织，

HOXA5

基因可能通过调控

Twist

基因的表达间接在WNT信号通路中调控E-cadherin蛋白表达，进而抑制卵巢癌发生、发展。

HMGB1是位于人13q12号染色体上的一类染色质蛋白，不仅存在于细胞核内，还广泛存在于人体组织中。研究显示，细胞核内的HMGB1参与DNA的修复过程和蛋白间的连接反应，还可调节类激素相关反应；而细胞外的HMGB1可介导细胞分化、血管生成、心肌重组、组织修复、糖尿病生成等病理生理学过程。随着对HMGB1研究的不断深入研究，结果发现，HMGB1在胃癌、胰腺癌、直肠癌等恶性肿瘤组织中过表达，且与肿瘤的发生发展、淋巴结转移及肿瘤细胞浸润密切相关。

本研究结果显示，HOXA5在卵巢癌组织中低表达，HMGB1在卵巢癌组织中高表达，二者的异常表达与年龄、病理类型、临床分期可能无关，与淋巴结转移、组织学分级可能有关。周翠香研究结果显示，肿瘤组织中HOXA5表达下调，HMGB1表达上调，且均与细胞凋亡途径相关。研究显示，Twist具有抗细胞凋亡的作用，HOXA5可抑制Twist的表达，表明HOXA5可通过抑制Twist的表达影响下游WNT信号通路中E-钙黏蛋白的表达，从而促进细胞凋亡，抑制肿瘤的发生发展。既往研究显示，上皮性卵巢组织中HMGB1蛋白的阳性表达率明显高于良性上皮性卵巢肿瘤组织及卵巢正常组织，且凋亡指数明显降于良性上皮性卵巢肿瘤组织及卵巢正常组织，表明HMGB1可能通过抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤发生发展。研究显示，HOXA5、HMGB1与恶性肿瘤的淋巴结转移、组织学分级相关的增殖、侵袭、浸润机制有关，因此，有淋巴结转移、低分化的卵巢癌患者卵巢癌组织中HOXA5表达下调、HMGB1表达上调。本研究进一步分析卵巢癌组织中HOXA5、HMGB1表达的相关性，结果显示，HMGB1表达与HOXA5呈负相关（r=-0.371，P＜0.05），表明 HMGB1、HOXA5的表达相互影响，可能通过介导p53、caspase相关信号通路，抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的进一步发展。

综上所述，HOXA5及HMGB1在上皮性卵巢癌组织中异常表达，可作为上皮性卵巢癌早期诊断及治疗的一个选择性靶点。但由于本研究纳入样本量较少、研究内容有限，关于HOXA5及HMGB1在肿瘤发生发展中的作用机制尚需进一步更深入的研究证实。