分子筛辅助人参须根粉快速制备人参皂苷Rg5的工艺研究

叶安琪，张浩然**，张跃伟*，李 玲，成乐琴*

(1.吉林化工学院 化学与制药工程学院,吉林 吉林 132022；2.吉林省彩森仁生物科技有限责任公司,吉林 吉林 132022)

人参(Panax ginseng C.A.Mey)属五加科草本植物[1]，是一种传统的中草药，因根形似人而得名，主要生长在中国、韩国和日本等亚洲国家，现被世界各地广泛使用已有数千年的历史[2-3].人参皂苷是其主要成分之一，含量在4%左右[4-5]，目前有123种人参皂苷已被鉴定[6].近年来，国内外对人参皂苷的药理作用及其分子机制进行了大量的研究，稀有人参皂苷的药用潜力逐渐被发现[7-9].稀有人参皂苷Rg5是蒸参的主要成分之一[10]，常用于预防和治疗各种疾病，如糖尿病、癌症、免疫力过低以及记忆阻碍和过敏性疾病等[11-16].由于蒸参过程通常需要比较长的时间，操作繁琐，而且对制备特定皂苷的选择性较差，因此如何由人参须根粉快速制备稀有人参皂苷Rg5凸显出其重要价值.

实验研究发现，在稀有人参皂苷Rg5的制备中加入壳聚糖、皂土等作吸附剂，可以有效提高人参皂苷Rg5的收率[17].分子筛是一种结晶型的硅铝酸盐，他的表面积大、孔结构规整，具有良好亲水性能，可作为吸附剂、催化剂和催化剂载体.前期探索实验表明，分子筛与壳聚糖、皂土等吸附剂一样也显示出良好的人参皂苷Rg5的抑制作用.本实验研究在分子筛辅助下，利用多功能改进型索氏提取器从人参须根粉中高效提取制备人参皂苷Rg5的制备工艺，并进行工艺优化，为人参皂苷Rg5的低成本、快速制备提供技术支持.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

人参须根粉(纯度≥80%)：吉林省通化市彩森仁生物有限公司提供；人参皂苷Re、Rg5对照品(纯度≥98%)：成都曼斯特公司；A型分子筛(使用前研细，900 ℃活化2 h)；乙腈(色谱纯)：瑞典欧森巴克化学公司；纯净水，杭州哇哈哈集团有限公司；甲醇(色谱纯)、正丁醇、高氯酸等溶剂(国产分析纯)：天津大茂化学试剂厂；香草醛(分析纯)：天津市光复精细化工研究所；冰乙酸(分析纯)：天津市福晨化学试剂厂.

多功能改进型索氏提取器：自制(结构见ZL201720660247.5)；高效液相色谱仪：大连依利特分析仪器有限公司；色谱柱Pinnacle Ⅱ C18：RESTEK U.S.的250 mm×4.6 mm，5 μm；紫外分光光度计(760CRT)：上海仪电仪器有限公司；高速离心机(H2050R)：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；旋转蒸发仪(RE202)：日本Yamato；智能磁力搅拌器(ZNCL-GS)：郑州市亚荣仪器有限公司.

1.2 实验原理

具体实验原理见图1.

图1 人参皂苷Rg5的制备原理

1.3 实验方法

1.3.1 紫外-可见分光光度法测定人参须根总皂苷含量

(1) 人参皂苷Re对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Re对照品3.3 mg，加色谱纯甲醇定容至10 mL，得浓度为0.33 mg·mL-1的人参皂苷Re对照品溶液.

(2) 标准曲线的绘制

精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL人参皂苷Re对照品溶液于10 mL的具塞试管中，70 ℃水浴中蒸干.于每个具塞试管中加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴加热15 min后准确加入5 mL冰醋酸摇匀，在400～800 nm全波长扫描中显示最大吸收的542 nm波长处测定吸光度值(A)，以人参皂苷Re浓度(C，μg·mL-1)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线.

1.3.2 液相色谱分析法测定人参皂苷Rg5的含量

(1) 人参皂苷Rg5对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg5对照品3.0 mg，加色谱纯甲醇定容至10 mL，得浓度为0.30 mg·mL-1的人参皂苷Rg5对照品溶液.

(2) 标准曲线的绘制

精密移取0.2、0.5、1.0、2.5 mL人参皂苷Rg5对照品溶液于10 mL容量瓶中，用色谱纯甲醇定容配成不同已知浓度的人参皂苷Rg5对照品溶液，经0.45 μm滤膜过滤后，进行HPLC分析，并以人参皂苷Rg5浓度(C，μg·mL-1)为横坐标，峰面积(mV)为纵坐标，绘制标准曲线.

(3) HPLC分析条件

色谱条件[18]：流速:1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；流动相为：(A)乙腈，(B)水.梯度洗脱程序：0.00～10.00 min，A：22%；10.00～20.00 min，A:22%；20.00～25.00 min，A:27%；25.00～45.00 min，A:31%；45.00～60.00 min，A:38%；60.00～65.00 min，A:52%；65～75 min，A:52%；75.00～82 min，A:55%；82.00～82.10 min，A:60%；82.10～100.00 min，A:90%；100.00～100.10 min，A：90%；100.10～120.00 min，A：22%.

1.3.3 单因素考察

在自制多功能改进型索氏提取器的提取筒中加入2.0 g人参须根粉和10 mL甲醇，蒸馏瓶中加入30 mL甲醇和350 μL浓盐酸，再分别加入3A、4A、5A分子筛0.3 g，设定提取筒温度为70 ℃，恒温油浴锅温度110 ℃，转速300 rpm条件下加热提取人参须根粉4 h.当提取筒中开始有回流液时，调节提取筒活塞使回流液与提取溶剂气化均衡.提取结束后，冷却静置、离心，取上清液，得人参提取液.移取人参提取液40 μL，置于10 mL的具塞试管中，按1.3.1(2)方法进行样品处理得供试品溶液1，在542 nm波长处测定吸光度值(A)，利用紫外-可见分光光度法测定人参须根总皂苷含量.准确移取1/25人参提取液，调节pH至6～7，旋蒸至干，溶于4 mL色谱纯甲醇得供试品溶液2，利用HPLC分析进行人参皂苷Rg5的含量测定.

(2) 分子筛用量对人参皂苷Rg5的制备影响

在自制多功能改进型索氏提取器的蒸馏瓶中，分别加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g 的4A分子筛，其他条件不变，依照“1.3.3 (1)”项方法提取制备人参皂苷Rg5，并进行人参总皂苷和人参皂苷Rg5的含量测定.

(3) 溶剂用量对人参皂苷Rg5的制备影响

在自制多功能改进型索氏提取器的蒸馏瓶中，分别加入20、25、30、35、40 mL甲醇溶液，其他条件不变，依照“1.3.3 (1)”项方法提取制备人参皂苷Rg5，并进行人参总皂苷和人参皂苷Rg5的含量测定.

(4) 提取筒温度对人参皂苷Rg5的制备影响

在自制多功能改进型索氏提取器中，分别改变提取筒温度为55、60、65、70、75 ℃，其他条件不变，依照“1.3.3 (1)”项方法提取制备人参皂苷Rg5，并进行人参总皂苷和人参皂苷Rg5的含量测定.

青海省藏羊主要集中在海北的祁连县、天峻县、兴海县、同德县和玉树州、果洛州。早期，青海藏羊主要以产毛为主，饲养管理粗放，产肉性能较低。近年来，由于羊毛国际市场变化莫测，羊毛价格浮动较大，以产肉为主的藏羊得到重视，肉羊饲养量逐渐加大，青海省藏羊肉资源也随之增加。随着藏羊肉资源的日益丰富和青海省科学技术的发展，藏羊肉产业也得到了相应的发展。目前已经开发出了几种迎合市场需求的藏羊肉产品，包括冷鲜藏羊肉等深加工食品和袋装羊肉串、速食羊杂等休闲食品。但是，青海省藏羊加工产业发展整体水平相对较低，存在着较为明显的问题，主要表现在：

(5) 提取时间对人参皂苷Rg5的制备影响

在自制多功能改进型索氏提取器中，分别提取2、3、4、5、6 h，其他条件不变，依照“1.3.3 (1)”项方法提取制备人参皂苷Rg5，并进行人参总皂苷和人参皂苷Rg5的含量测定.

2 结果与讨论

2.1 人参皂苷Re标准曲线的绘制

将不同质量人参皂苷Re对照品经5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸处理后在542 nm处进行吸光度测定，以人参皂苷Re对照品的质量浓度为横坐标x (μg·mL-1)，以吸光度为纵坐标y(A)，绘制标准曲线(见图2).

浓度/(μg·mL-1)图2 人参皂苷Re的标准曲线

根据图2可知，Re的回归方程为y=0.023 9x-0.009 1，方程相关系数R2=0.999 5，表明人参皂苷Re在11～55 μg·mL-1浓度范围内与吸光度的线性关系良好.

2.2 人参皂苷Rg5标准曲线的绘制

将不同浓度人参皂苷Rg5对照品的甲醇溶液经0.45 μm滤膜过滤后在203 nm波长下进行HPLC分析，以人参皂苷Rg5对照品的质量浓度为横坐标x (μg·mL-1)，以峰面积为纵坐标y(mv)，绘制标准曲线(见图3).

浓度/(μg·mL-1)图3 人参皂苷Rg5的标准曲线

根据图3可知，回归方程为y=14.274x+ 6.376 1,相关系数R2=0.999 0，表明Rg5浓度在6～300 μg·mL-1范围内与峰面积的线性关系良好.

2.3 单因素实验结果分析

2.3.1 分子筛种类对人参皂苷Rg5的制备影响

3A、4A、5A分子筛是3种A型分子筛，所带金属离子各不相同，3A是K+型分子筛，而4A和5A是Na+和Ca2+型分子筛.为了考察不同的A型分子筛对制备人参皂苷Rg5的影响，只改变分子筛的种类进行了由人参须根粉制备人参皂苷Rg5的实验，如表1所示.

表1 分子筛种类对人参皂苷提取的影响

由表1可以看出，在不同A型分子筛的辅助下得到的人参提取物中，人参总皂苷含量没有明显区别，但人参皂苷Rg5的得率有显著差异.实验结果表明，加入4A分子筛时人参皂苷Rg5的得率为3.13%，明显高于加入3A分子筛或5A分子筛，说明A型分子筛中因金属的不同而引起的分子筛的不同结构对Rg5的制备影响较大.因Na+型分子筛(4A分子筛)效果明显优于K+型分子筛(3A分子筛)及Ca2+型分子筛(5A分子筛)，因此用4A分子筛为辅助试剂进行了进一步的优化实验.

2.3.2 分子筛的用量对人参皂苷Rg5的制备影响

为了考察4A分子筛的用量对人参皂苷Rg5的制备影响，在其他条件不变条件下，加入0.2～0.6 g分子筛进行了由人参须根粉制备人参皂苷Rg5的实验，如表2所示.

表2 分子筛用量对人参皂苷提取的影响

由表2可以看出，分子筛用量基本不影响人参总皂苷的含量，但对人参皂苷Rg5的得率影响显著，分子筛用量过少或过多都不利于人参皂苷Rg5的制备.这是因为分子筛用量减少时，人参皂苷Rg5的分解增多，Rg5得率下降；分子筛用量增多时，提取得到的原人参二醇组皂苷的转化率下降，Rg5得率下降.结果表明，分子筛用量为0.3 g时人参皂苷Rg5的得率最高.

2.3.3 提取剂用量对人参皂苷Rg5的制备影响

提取剂的用量不仅影响溶质的溶解能力，还会影响酸浓度，从而进一步影响酸对人参皂苷的催化效果.为了考察提取剂的用量对人参皂苷Rg5的制备影响，蒸馏瓶中分别加入20～40 mL溶剂进行人参须根粉的提取实验，如表3所示.

表3 提取剂用量对人参皂苷提取的影响

由表3可以看出，人参总皂苷的含量随着提取剂用量的增加略有增大，但人参皂苷Rg5的得率并未因总皂苷含量的增大而同步增大.实验结果显示，当提取剂用量为30 mL时，人参皂苷Rg5的得率最高，提取剂用量进一步提高时Rg5得率反而有所下降，这说明提取剂用量过多时，酸浓度会下降，酸催化效果随之减弱，因此提取的人参皂苷的转化率降低，致使生成的人参皂苷Rg5减少.

2.3.4 提取筒温度对人参皂苷Rg5的制备影响

溶质在溶剂中的溶解度与温度的高低有密切的关系.为了考察提取温度对制备人参皂苷Rg5的影响，其他条件不变，只改变提取筒温度进行了人参须根粉的提取实验，如表4所示.

表4 提取筒温度对人参皂苷提取的影响

由表4可见，提取筒温度为55 ℃时，无论是人参总皂苷的含量还是人参皂苷Rg5的得率均为最低；但随着提取筒温度升高至60 ℃时，人参总皂苷的含量和人参皂苷Rg5的得率均有所增加；而提取筒温度进一步升高至60～75 ℃之间时，人参总皂苷的含量无明显变化，人参皂苷Rg5的得率略有下降.

2.3.5 提取时间对人参皂苷Rg5的制备影响

人参须根粉中提取制备人参皂苷Rg5的过程包含人参皂苷的提取和人参皂苷的转化过程.人参总皂苷的提取量多，人参皂苷的转化量多，同时生成的Rg5分解少，才能得到较高得率的人参皂苷Rg5.为了考察提取时间对制备人参皂苷Rg5的影响，在其他条件不变的情况下分别对人参须根粉提取了2～6 h，如表5所示.

表5 提取时间对人参皂苷提取的影响

由表5可知，提取时间为2 h时，提取总皂苷的含量和人参皂苷Rg5的得率均较低，说明提取时间短，提取到的人参总皂苷少，人参皂苷Rg5的得率也随之变少.当提取时间增至3 h时，总皂苷含量达到峰值，而进一步延长提取时间，总皂苷含量没有明显变化，说明提取时间达到3 h时，就可以将人参须根粉中的大部分人参皂苷提取出来.而对于人参皂苷Rg5，当提取时间为4 h时得率达到最大值3.20%，进一步延长提取时间，得率反而明显下降，这是因为提取时间过长，体系中没有新的人参皂苷被提取，而人参皂苷Rg5的分解成为主反应，致使Rg5的得率下降.

为了验证自制多功能改进型索氏提取器在提取人参总皂苷和制备人参皂苷Rg5的效果，在最佳提取条件下，利用多功能改进型索氏提取器及传统型索氏提取器分别对人参须根粉的进行加热回流提取.

由图4的HPLC对比图可以发现，多功能改进型索氏提取器提取人参须根粉时人参皂苷Rg5的得率是传统型索氏提取器的1.46倍.这说明利用多功能改进型索氏提取器提取人参皂苷时，对人参皂苷的提取效果明显优于传统型索氏提取器.

t/min图4 不同提取器提取人参皂苷Rg5的HPLC对比图

3 结 论

本实验利用多功能改进型索氏提取器，在分子筛辅助下酸催化制备了人参皂苷Rg5.分子筛可以有效抑制人参皂苷Rg5的分解，实现高收率、高效制备稀有人参皂苷Rg5的目的.与传统型索氏提取器的对比实验表明，自制多功能改进型索氏提取器提取制备人参皂苷Rg5的得率是传统型索氏提取器的1.46倍，显示出非常好的人参皂苷的提取和转化效果.本工艺将人参皂苷的转化与提取过程合二为一，同时完成了提取液与人参渣的固液分离，不仅耗时短，且操作方便、快捷，这对于稀有人参皂苷Rg5的大量制备以及相关产品的开发具有重要借鉴意义.