体外心肺复苏动物模型的研究进展

蔡金霞 ，刘燕青 ，刘子泉 ，李文莉 ，陈原森 ，王海旺 ，史 源 ，韩 伟，樊毫军 ， 张伟丽

心脏骤停（Cardiac Arrest，CA）是一个全球性的重大公共卫生问题[1]，每年我国院外因CA而死亡的人数高达54.4万[2]，院内和院外的存活率分别为24.9%和12%[3-4]。1992年，美国心脏协会发布了“生命链”（Chain of Survival）理论，2000年国际上出台了第一部心肺复苏（Cardiopulmonary Resuscitation，CPR）指南标准[5]，这为CA患者带来了福音[6]。随着CPR技术的推广与普及，使得CA患者的存活率得到了提升。然而，由于救治的时效性和预后等问题，导致心肺复苏后的高发病率和死亡率仍然存在[7]。在过去的几十年里，体外膜肺氧合（Extracorporeal Membrane Oxygenation，ECMO）已被用作急诊科、重症监护室或导管室中“难治性CA”患者的替代复苏方法[8-11]。最近的一系列研究表明，与传统的CPR技术相比，采用ECMO策略进行血液动力学支持的体外心肺复苏（Extracorporeal Cardiopulmonary Resuscitation，ECPR）可以在一定程度上提升院内和院外CA患者的生存率，改善神经系统预后[12-18]，可以使其生存率达到40%至50%[19]。ECPR将体外血液循环与氧合作为复苏工具[20]，越来越多地被用于CA患者的紧急救治，逐渐发展成为“难治性CA”的一种可行的救治手段[21]。

目前ECPR技术在临床上的应用尚不成熟，而建立稳定、可靠的动物模型探索ECPR的适应症、启动时机、脏器保护机制等问题，对于该技术的实际应用具有重要的意义。当前ECPR相关动物实验研究最常采用的实验动物多为猪和大鼠，其各具优势，不同研究针对的侧重点也有所不同[22]。因此，本文对目前ECPR相关的动物实验研究进展进行综述，主要包括以大鼠和猪为主的ECPR动物模型的实验动物选取、模型建立方法以及检测指标方面目前主流的研究方法，以期对ECPR基础研究现状有所了解，对后续实验研究方向有所推进和拓展。

1 实验动物的选取

目前已有研究多选取猪和大鼠制作ECPR模型[1,18,20,22-34]。 选择大型动物制作模型可以更好地模拟ECPR的临床环境，但其需要较多的成本和劳动力[22]；而小动物具有获取方便，价格低廉，心血管解剖结构及功能与人类相近，可在基因及分子水平进行干预等优点[33]。

1.1 大鼠CA模型普遍采用健康的成年雄性SD（Sprague Dawley，SD）大鼠，体重范围多为450～550 g[22,32-34]。在慢性疾病的基础上建立CA大鼠模型的研究比较少见，主要是因为其操作难度大，模型制作周期较长[22,32-34]。目前，ECPR大鼠模型已初步建立，大多数研究采用窒息法致大鼠CA[32-34]，也有研究采用电刺激法诱发室颤（Ventricular Fibrillation, VF）致CA[22]，一般窒息性CA会产生更严重的心肌损伤和线粒体损伤模式，而VF模型由于其操作难度大，缺乏稳定性和可重复性[9]。二者均采用静脉-动脉（Venous -Arterio，V-A）ECMO模式辅助下进行ECPR[22,32-34]。

1.2 猪CA模型研究一般采用雄性成年猪，体重范围在35～65 kg[6,8,24,28,35]之间。猪ECPR模型的制作方法较多：大多数研究采用电刺激法[18,20,26-31]和冠状动脉结扎法[1,23-25]，二者均可导致VF，继而引发CA；采用窒息法诱导CA的研究较少[9,36]；有研究采用35%控制性失血制作失血性休克模 型，然后给予氯化钾以引发CA；此外，还有研究采用一氧化碳中毒直至中枢衰竭诱发CA。

2 动物模型的建立方法

2.1 麻醉及ECMO循环准备麻醉药物多选用七氟烷[32]（诱导和苏醒较现有的强效麻醉药快，对心血管影响比异氟烷小）、异氟烷[33-34]或七氟醚[22]诱导并维持麻醉，多采用气管切开[32-34]插管，并给与保护性机械通气，采用经口气管插管[22]进行呼吸维持的模型较少。

ECMO系统大多采用滚压泵，普通管路（暂无肝素涂层），管路预充液多为羟乙基淀粉[32-34]。大鼠V-A ECMO循环通路一般通过右颈外静脉-尾动脉[32-33]或右颈外静脉-右股动脉[34]建立，而猪则通过颈内静脉-股动脉[8]或股静-动脉[9,36]建立。血管均用丝线远端结扎，近端固定，ECMO管路夹闭备用[32]。

2.2 窒息法致大鼠CA模型断开呼吸机并夹闭气管插管，记录窒息至复苏各阶段的时间，监测平均动脉压（Mean Arterial Pressure，MAP）。当MAP低于25 mmHg[32-33]或20 mmHg [34]以下，判定大鼠窒息性CA成功，非干预间隔4 min[32-33]或6 min[34]后开始抢救。

2.3 电刺激法致大鼠CA模型起搏导管经右颈外静脉推进约5 cm到达右心室内膜诱导VF。将粘附性除颤手柄固定在侧胸，连接双相手动除颤器，循环管路预充15 mL平衡晶体溶液。VF前90 s，关闭七氟醚，用50 Hz/5 mA交流电持续刺激2 min诱发VF，如发生自发性除颤，重复刺激30 s。心电图和MAP读数证实VF后，拔除起搏导管。CA 持续10 min后开始抢救。在复苏后2 min尝试除颤（2次电击/5 J），此后每隔2 min进行一次除颤[22]。

2.4 电刺激法致猪CA模型猪的电刺激法实验步骤与大鼠类似，对于发生VF不同时间（6 min[27]、8 min[29]12 min[8]、15 min[31]、20 min[18]、30 min[28]）后的猪，进行CPR 2 min[8]或 45 min[30]后再进行ECPR支持一定的时间（4 min[8]、5 min[31]、6 min[29]，30 min[28]），然后除颤，继续体外生命支持2 h[31]、3 h[30]、6h[18,28]或24h[27]。MAP>60 mmHg持续20 min或收缩压>80 mmHg定义为自主循环恢复（Restoration Of Spontaneous Circulation，ROSC）[8]。

2.5 心脏缺血法致猪CA模型有文献对19种心力衰竭V-A ECMO模型进行了综述，发现冠状动脉左前降支结扎诱发心力衰竭的共9篇[25]，可见该方法在大动物ECPR模型中比较常用。CA 5 min[1]后，开始常规的CPR 15 min[1]、20 min[24]，之后在正常体温下启动ECPR，ECMO血流量为65～70 ml.kg-1[23]，总持续时间为240 min[1]、6 h[24]。动物分别在ECPR的20 min[1]或120 min[1]时随机进行早期或晚期冠状动脉再灌注。

2.6 窒息法致猪CA模型采用低氧法在完全神经肌肉阻滞下进行窒息诱发CA，4.5 min后启动机械通气，进行胸部按压5 min （100次/min），股动脉、静脉置管建立ECMO循环通路，ROSC目标为MAP 达到60 mmHg以上，6 h后终止实验，心脏内注射氯化钾处死动物[9,36]。

3 ECPR的建立

连接呼吸机并开放气管插管，采用纯氧[32-33]或95%氧[22,34]进行通气。然后行ECPR，使用心肺复苏机进行胸外按压，监测呼吸、血流动力学及血气指标[33]。如果心脏没有自发复律，则给予一定剂量肾上腺素和8.4%碳酸氢钠等药物，以纠正代谢性酸中毒[34]。若持续抢救≥15 min或20 min[22]，仍无 ROSC，则判定复苏失败[32]。复苏后观察30 min[22]、1 h[33]、1.5 h[32]或2.5 h[34]后，停止所有辅助治疗，ECMO流量逐渐减少，撤除管路，过量麻醉处死实验动物并取材[32]。

4 检测指标

检测实验动物的基线资料如体重、肛温、MAP、心率等，持续监测呼吸、血流动力学，分别于手术前5 min[22]、30 min[32]，大鼠在ROSC后5 min[22]、15 min[22]、30 min[32]或1 h[34]采动脉血进行血气及血细胞比容分析，猪分别在基线期、复苏时以及复苏后1、2、4和6 h[8,26,29]获取血流动力学和血液样本。如果动物未饮水，体重减轻，皮下注射晶状液。在出现痛苦症状时每天皮下注射丁丙诺啡两次[22]。收集血清和尿液等样品的生理参数，以及对脑和肾脏、心脏等组织进行病理学观察。

5 展 望

随着ECPR动物模型建立方法的不断优化，有助于更方便、更有效地认识ECPR治疗过程中产生的并发症与其发展规律，从而研究相应的防治措施。ECPR作为一种复杂的多学科合作诊疗的体外生命支持技术，用于院外、院内心脏骤停患者的病例逐渐增多[32]。国内外已有研究表明，在专业团队的指导下实施ECPR可有效提高患者的存活率。由于ECPR在公共卫生领域应用数量的逐年增长，其在战场重伤急救中也逐渐体现了潜在的可行性和应用价值。因此，相信随着广大的科研人员对相关领域的不断深入研究，ECPR更深层次的机制探索也会给临床的治疗手段带来新思路。