早期隐性梅毒对慢性HIV感染者CD4+T及CD8+T淋巴细胞内Caspase-1/3水平的影响

宋冰冰 赵金雪 翁文佳 高艳青

1首都医科大学附属北京康复医院皮肤科,北京，100041；2北京市房山区第一医院皮肤科，北京，102400；3首都医科大学附属北京佑安医院皮肤科，北京，100069

随着HIV/AIDS的流行及其他危险因素的增多，如男男性接触(men who have sex with men，MSM)、静脉注射毒品，梅毒合并HIV的感染率越来越高。研究发现两种疾病可相互作用，如梅毒合并HIV感染且CD4+T淋巴细胞<350个/μL，发生神经梅毒概率增高[1，2]；另外，合并梅毒感染会加快HIV患者CD4+T淋巴细胞计数下降、HIV载量升高，促进HIV感染进展为AIDS[3]。既往课题组研究[4]发现梅毒感染加快HIV感染者CD8+T淋巴细胞的凋亡，并且除了活化诱导的凋亡外，可能存在其他的机制。而对于HIV感染者CD4+T淋巴细胞，研究发现HIV有效感染的活化CD4+T细胞发生死亡是通过Caspase-3介导的凋亡，HIV无效感染的静止CD4+T淋巴细胞发生死亡是通过Caspase-1诱导的焦亡[5]。而梅毒是否能通过上述途径加速CD4+T及CD8+T淋巴细胞的死亡尚未有明确报道。本研究通过观察早期梅毒感染对HIV感染者CD4+T及CD8+T细胞Caspase-1/3水平的影响，初步探索早期隐性梅毒感染对HIV感染者外周血中CD4+T及CD8+T淋巴细胞凋亡和焦亡的影响。

1 材料与方法

1.1 病历资料 研究对象来自我院感染中心规律随访的MSM队列。18例早期隐性梅毒合并慢性HIV感染(外周血CD4+T淋巴细胞计数≥350个/μL，HIV感染时间>6个月) ，早期隐性梅毒定义为感染2年内仅有梅毒血清学改变，但无任何临床表现；18例慢性 HIV感染(外周血CD4+T淋巴细胞计数≥350个/μL，HIV感染时间>6 个月)。除外年龄<18岁、妊娠、合并其他感染性疾病者，如结核感染等。合并组确诊梅毒后经过苄星青霉素240万U驱梅治疗，每周一次，共三次。所有HIV感染者均未进行抗高效逆转录病毒治疗(HAART)。见表1。

表1 两组患者基线资料

1.2 研究方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度离心法分离PBMC 合并组及HIV感染组取冻存PBMC，于42℃恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，快速晃动冻存管，使冻存的细胞在1 min内解冻。

1.2.2 荧光染色 复苏好的PBMC加入表面抗体标记(CD3-APC，CD4-PERCP，CD8-APC-cy7)，室温避光染色20 min。细胞内染色：加入Caspase-3，Caspase-1抗体，室温孵育45 min，PBS洗涤2次后，用2%多聚甲醛重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.2.3 CD4/CD8及细胞内Caspase-1/Caspase-3测定 采用FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测，并采用 Flowjo 7.6.1软件进行数据分析。

2 结果

2.1 两组CD4+T淋巴细胞中Caspase-1/3含量的比较 见图1、2 。单纯HIV感染组及合并组CD4+T淋巴细胞中Caspase-1含量分别为(0.132±0.098)、(0.463±0.676)，合并组高于单纯HIV组，两组间差异有统计学意义；单纯HIV感染组及合并组CD4+T淋巴细胞中Caspase-3含量分别为(4.717±7.35)、(9.433±11.85)，两组未见统计学差异。

图1 HIV单纯感染组和HIV合并早期隐性梅毒感染组中CD4+T淋巴细胞中Caspase-1含量情况，*P<0.05 图2 HIV单纯感染组和HIV合并早期隐性梅毒感染组中CD4+T淋巴细胞中Caspase-3含量情况，*P<0.05 图3 HIV单纯感染组和HIV合并早期隐性梅毒感染组中CD8+T淋巴细胞中Caspase-1含量情况，*P<0.05 图4 HIV单纯感染组和HIV合并早期隐性梅毒感染组中CD8+T淋巴细胞中Caspase-3含量情况，*P<0.05

2.2 两组CD8+T淋巴细胞中Caspase-1/3含量的比较 见图3、4。单纯HIV感染组及合并组CD8+T淋巴细胞中Caspase-1含量分别为(0.127±0.094)、(0.334±0.456)，合并组高于单纯HIV组，两组间差异有统计学意义；单纯HIV感染组及合并组CD8+T淋巴细胞中Caspase-3含量分别为(8.47±14.78)、(16.23±14.91)，两组未见统计学差异。

2.3 合并组治疗6个月后CD4+T淋巴细胞中Caspase-1/3含量与基线的比较 苄星青霉素驱梅治疗6个月后，CD4+T淋巴细胞中Caspase-1含量为(0.156±0.103)，较治疗前下降，但无统计学差异。Caspase-3含量为(2.32±3.925)，较前明显下降，有统计学意义。见图5、6。

2.4 合并组治疗6个月后CD8+T淋巴细胞中Caspase-1/3含量与基线的比较 苄星青霉素驱梅治疗6个月后，CD8+T淋巴细胞中Caspase-1含量为(0.158±0.108)，较治疗前下降，但无统计学差异；Caspase-3含量为(2.38±2.05)，较前明显下降，有统计学意义。见图7、8。

2.5 单纯HIV感染组6个月定期随访时CD4+T淋巴细胞中Caspase1/3含量分别为(0.076±0.066)及(1.53±1.828)，CD8+T淋巴细胞中Caspase1/3含量分别为(0.067±0.07)及(2.156±3.026)，均与基线无统计学差异。

图5 HIV合并早期隐性梅毒感染组在治疗前和治疗6个月后CD4+T淋巴细胞中Caspase-1含量变化情况，*P<0.05 图6 HIV合并早期隐性梅毒感染组在治疗前和治疗6个月后CD4+T淋巴细胞中Caspase-3含量变化情况，*P<0.05 图7 HIV合并早期隐性梅毒感染组在治疗前和治疗6个月后CD8+T淋巴细胞中Caspase-1含量变化情况，*P<0.05 图8 HIV合并早期隐性梅毒感染组在治疗前和治疗6个月后CD8+T淋巴细胞中Caspase-3含量变化情况，*P<0.05

3 讨论

HIV感染后，会攻击人体免疫系统，人体细胞免疫会明显受损，而梅毒是以细胞免疫为主参与梅毒螺旋体的清除[2，6，7]。故既往研究[8，9]发现二者可相互影响，促进疾病发展，及时有效的治疗对疾病的转归会有帮助。

在HIV感染过程中，CD4+T淋巴细胞进行性减少是疾病进展的核心环节。既往研究[10]发现HIV感染的CD4+T淋巴细胞减少与凋亡密切相关，但随着研究的深入，不同于凋亡与坏死的一种新的程序性细胞死亡方式-焦亡被发现，它是由Caspase-1介导，在许多感染性疾病中发挥重要作用。在HIV感染的致病机制研究中认为，CD4+T淋巴细胞主要通过焦亡的方式对病毒DNA作出反应,从而促进前炎症因子释放,使大量健康CD4+T淋巴细胞募集到感染区域,为HIV感染提供新的细胞资源,最后导致CD4+T淋巴细胞死亡,形成恶性循环[11]。目前认为HIV有效感染的活化CD4+T淋巴细胞发生死亡是通过Caspase-3介导的凋亡，HIV无效感染的静止CD4+T淋巴细胞发生死亡是通过Caspase-1诱导的焦亡[10，11]。

目前研究认为梅毒螺旋体的清除主要是通过细胞免疫参与。在梅毒感染的过程中，其外周血T淋巴细胞亚群不断发生变化。既往研究显示[12]，二期梅毒患者外周血中CD4+T淋巴细胞比例显著降低,而CD8+T淋巴细胞比例显著升高,CD4+∶CD8+比值降低;而一期和潜伏梅毒患者, CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例无显著变化。此研究表明T淋巴细胞亚群在梅毒的发病机制中发挥重要作用，不同梅毒分期T淋巴细胞亚群变化的机制可能揭示梅毒的致病机制。另外发现，一、二期梅毒患者外周血中CD4+T淋巴细胞凋亡比例明显升高，而早期潜伏梅毒患者CD4+T淋巴细胞凋亡比例增高无统计学意义，提示不同分期梅毒患者外周T淋巴细胞死亡机制可能不同。关于梅毒螺旋体感染过程中T淋巴细胞亚群的焦亡情况尚无研究报道，本课题组目前正在对不同分期的单纯梅毒感染者外周血T淋巴细胞亚群焦亡及凋亡情况进行研究。本研究初步分析梅毒螺旋体感染对梅毒合并HIV共感染者外周血中CD4/CD8+T淋巴细胞亚群焦亡和凋亡的影响，提高我们对梅毒和AIDS病理机理的认识，为进一步深入研究提供基础。

在本研究中，发现早期隐性梅毒合并HIV感染CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞中焦亡指标Caspase-1较单纯HIV感染组明显升高，反应在一定程度上梅毒可能通过焦亡途径加速共感染者中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的死亡。合并组中CD4/CD8+T淋巴细胞虽然凋亡指标Caspase-3也呈增加趋势，但无统计学差异，一方面可能与样本量较小有关，另一方面，本研究组为早期隐性梅毒患者，免疫反应不如一期、二期梅毒强烈，这与既往单纯早期隐性梅毒未增加CD4+T淋巴细胞的凋亡相符[12]。另外，在经过苄星青霉素驱梅治疗后，CD4/CD8+T淋巴细胞的凋亡指标Caspase-3明显下降，反应及时有效的驱梅治疗可以降低梅毒螺旋体对CD4/CD8+T淋巴细胞的影响。驱梅治疗对焦亡指标Caspase-1的水平虽有下降趋势，但无统计学意义。

梅毒和AIDS都是性传播疾病，T淋巴细胞在二者的病理机制中具有重要意义，探索两种感染对CD4+和CD8+T淋巴细胞不同的程序死亡通路的影响，可以提高我们对梅毒和AIDS病理机制的认识，有助于研发新的有效控制梅毒感染和AIDS进展的治疗策略。同时，梅毒的早期诊断和治疗对于CD4+和CD8+T淋巴细胞的更新具有重要意义。

由于本研究样本量较小，我们的研究假设仍需要大样本的研究进一步证实。同时，增加一组单纯早期隐性梅毒可能会更全面的说明本文结论。另外，Caspase可能仅是T淋巴细胞程序性死亡通路的一个效应分子，梅毒螺旋体是否会通过其它途径影响HIV感染者CD4/CD8+T淋巴细胞的更新仍需要进一步研究，还需将不同分期的早期梅毒纳入研究，进一步观察梅毒在不同的感染阶段对CD4/CD8+T淋巴细胞更新的影响。