柴胡加龙骨牡蛎汤对心肌梗死合并焦虑大鼠海马区NLRP3/GSDMD炎性信号通路的影响

侯季秋，陈雅丽，王 超，马 迪，靳会会，安 莹，赵海滨

(1. 北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

随着生活节奏的改变，焦虑的发病率日益增高。WHO在2017年发布的精神疾病报告中显示，焦虑在心肌梗死患者中的发病率约为30%，远远高于在普通人中的发病率(5%～10%)[1]，而焦虑会增加心肌梗死后36%的心脏不良事件发生率[2]。最新研究表明，炎症反应与心肌梗死后焦虑的发生关系密切[3]，尤其是小胶质细胞的激活、NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性因子释放，是焦虑发生的重要病理机制[4]。NLRP3是细胞内模式识别受体，由凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和效应蛋白Caspase-1组成，其出现在大脑神经系统炎症反应中，并与压力诱导的情绪障碍发病机制密切相关[5]。在小胶质细胞内，NLRP3激活后可通过活化Caspase-1，切割GSDMD蛋白，使其在细胞膜表面形成质膜孔(10～15 nm)而引起炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)释放的一种程序性炎性胀亡[6-8]。前期研究已证明，心肌梗死合并焦虑小鼠NF-κB等炎症介质含量明显高于非焦虑的心肌梗死大鼠[9]，柴胡加龙骨牡蛎汤在一定程度上可通过增加骨髓间充质干细胞动员，抑制心肌梗死合并焦虑大鼠的炎性反应，调节大鼠海马区谷氨酸受体N-甲基d天冬氨酸受体(NMDAR)和γ氨基丁酸A受体(GABAAR)神经递质紊乱，改善心肌梗死后的焦虑状态[10]。本研究从NLRP3/GSDMD通路介导海马区神经炎症进一步探析柴胡加龙骨牡蛎汤治疗心肌梗死合并焦虑的作用机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠，体质量(200±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(北京)2016-0011，饲养在北京中医药大学SPF级动物房。考虑心肌梗死造模成功率为70%～85%，购进60只大鼠。

1.2实验药物、试剂及仪器 柴胡加龙骨牡蛎汤组成：柴胡12 g、黄芩9 g、龙骨15 g、牡蛎15 g、生姜9 g、党参9 g、桂枝9 g、茯苓15 g、半夏9 g、大黄9 g、珍珠母15 g、大枣10 g，配方颗粒购自北京康仁堂药业有限公司。Anti-GSDMD抗体(ab219800)、Anti-NLRP3抗体(ab214185)、Anti-IL-1β抗体(ab9787)购于abcam公司，Caspase-1/p20/p10抗体(10663-1-AP)、IL-18抗体(10663-1-AP)、IL-1β抗体(10663-1-AP)购于proteintech公司。小动物呼吸机，高架十字迷宫，旷场及摄影机，全自动三导联心电图机，酶标仪(Thermo)，离心机，微量移液器，垂直电泳槽，电转仪，磁力搅拌器等。

1.3实验方法 将60只SD大鼠随机分为假手术组9只、心梗并焦虑组17只、心梗组17只、心梗并焦虑+中药组17只。心梗并焦虑组和心梗并焦虑+中药组先采用空瓶刺激方法进行焦虑造模，于造模第15天采用结扎冠状动脉左前降支方法进行心肌梗死造模。心梗组采用结扎冠状动脉左前降支方法进行造模；假手术组穿线后不打结，其余步骤同心肌梗死造模。①焦虑造模方法参考文献[8]：第1～7天每日9:00—9:10和21:00—21:10给予饮水，其余时间禁水。第8～21天每日早晚随机一个时间段给予空瓶，另一时间段喂水。造模期间大鼠自由饮食，造模周期共21d。②心肌梗死造模方法参考文献[9]：采用1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，经口连接气管插管后，连接小动物呼吸机，呼吸机模式：心率80次/min，潮气量2 mL/100 g，吸呼比1∶2。于左侧第三、第四肋骨间打开胸腔，暴露左心耳边缘区域，用5-0带线缝合针于左心耳前下方2 mm部位进行结扎。术后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常，40万IU青霉素预防术后感染，术后进行有效保暖。以术后第2天心电图I、aVL、V1～V6导联中6个以上导联出现病理性Q波为心肌梗死成功标志。心肌梗死造模后第2天，心梗合并焦虑+中药组给予柴胡加龙骨牡蛎汤10 mL/kg灌胃(参考文献[9]，给药量按成人体质量60 kg的6倍剂量折算，折合大鼠每日生药剂量为13.6 g/kg，每剂中药颗粒用100 mL蒸馏水混匀)，其余组灌胃等量蒸馏水，均1次/d，连续7 d。

1.4检测指标及方法

1.4.1心脏超声检测 实验结束后对各组大鼠进行心脏超声检测，记录左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVIDd)和左心室收缩末期内径(LVIDs)。

1.4.2行为学测试 ①高架十字迷宫实验：高架十字迷宫由4个高于地面50 cm的十字交叉架窄壁组成，包括2条开放臂(长、宽、高分别为50 cm、10 cm、1 cm)、2条封闭臂(长、宽、高分别为50 cm、10 cm、30 cm)、四臂之间的中央区(长、宽分别为10 cm、10 cm)及顶端摄像仪器。经15 min环境适应后，将大鼠面向开臂放入中央区，记录5 min内的活动情况，包括进入开放臂次数(OE)及开放臂停留时间(OT)、进入闭合臂次数(CE)及闭合臂时间(CT)，计算进入开放臂次数百分比和开放臂停留时间百分比。②旷场实验：设置100 cm×100 cm×40 cm的灰色旷场箱，底面有25个方格，正上方有专用记录摄像仪。将大鼠经过10 min环境适应后放入中央格，记录3 min内大鼠在旷场内运动情况，计算水平运动得分(后腿离开一格记1分)和垂直运动得分(前爪离地直立记1分)，评价大鼠水平运动和垂直运动能力。

1.4.3大脑海马区HE及尼氏染色 大鼠麻醉后，打开胸腔暴露心脏，将灌流针由心尖插入左心室，固定灌流针，先用生理盐水快速灌注后使用10%福尔马林溶液常速灌注固定，摘取大脑浸泡于4%的组织固定液中，经沉淀后，制备石蜡切片，进行苏木精-伊红(HE)染色及尼氏染色。每组内每张切片挑选海马区域3个200倍视野进行截图，截图时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。采用Image-Pro Plus 6.0软件，分别测量区域尼氏蓝色阳性面积及组织面积，计算尼氏阳性面积百分比。

1.4.4大脑海马区NLRP3、Caspase-1、GSDMD免疫组化检测 取制备的石蜡切片，按照试剂盒说明书进行操作。采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化图像进行半定量统计分析，每张切片采样测量3处，计算单位面积下阳性染色区域面积，以积分光密度值(IOD值)表示。

1.4.5大脑海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达Western blot检测 将海马组织剪碎提取总蛋白，经过蛋白浓度测定及蛋白变性，制备电泳胶，进行电泳分离及电转移，封闭、一抗二抗孵育，晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.5统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析,并使用GraphPad Prism 7.00制作图表。数据进行正态性检验和方差齐性检验，正态分布且方差齐采用单因素方差分析，方差不齐采用Welchi检验；不符合正态分布，组间比较采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠存活情况 经过结扎左冠脉前降支手术及慢性不可预知性空瓶刺激后，假手术组6只、心梗组9只、心梗并焦虑组8只、心梗并焦虑+中药组9只存活。

2.2各组大鼠心脏超声检测指标比较 与假手术组比较，心梗并焦虑组、心梗组、心梗并焦虑+中药组大鼠LVEF、LVFS均明显降低(P均<0.05)，LVIDd和LVIDs均明显增加(P均<0.05)，且心梗并焦虑组大鼠LVIDd明显高于心梗组(P<0.05)；与心梗并焦虑组比较，心梗并焦虑+中药组LVEF、LVFS均明显升高(P均<0.05)，LVIDd和LVIDs均明显缩短(P均<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠心脏超声检查结果比较

2.3各组大鼠行为学比较 高架十字迷宫实验：心梗并焦虑组大鼠进入开放臂次数所占比和开放臂停留时间所占比均明显低于假手术组和心梗组(P均<0.05)，而心梗并焦虑+中药组均明显高于心梗并焦虑组(P均<0.05)。旷场实验：心梗并焦虑组大鼠水平运动得分和垂直运动得分均明显少于假手术组(P均<0.05)，且运动得分明显低于心梗组(P<0.05)，而心梗并焦虑+中药组运动得分和垂直运动得分均明显高于心梗并焦虑组(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠行为学评测情况

2.4各组大鼠大脑海马区HE及尼氏染色情况比较 假手术组大鼠海马区神经细胞形态正常、轮廓清晰、圆润饱满, 胞质着色均匀, 细胞核位于细胞中央, 排列紧密；心梗组大鼠海马区神经细胞较假手术组减少，排列松散，细胞形态未发生明显改变；心梗并焦虑组大鼠海马区神经细胞发生了不同程度损伤,出现核固缩，细胞数量减少，细胞间隙变大；与心梗并焦虑组比较，心梗并焦虑+中药组大鼠海马区神经细胞排列相对紧密，胞质着色均匀, 细胞数量多。心梗并焦虑组和心梗组大鼠海马区尼氏阳性面积均明显低于假手术组(P均<0.05)，心梗组与心梗并焦虑组大鼠尼氏阳性面积比较差异无统计学意义(P>0.05)，心梗并焦虑+中药组明显高于心梗并焦虑组和心梗组(P均<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠脑部HE及尼氏染色情况

2.5各组大鼠海马区NLRP3、Caspase-1、GSDMD免疫组化检测情况比较 心梗并焦虑组和心梗组大鼠海马区NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达IOD值均明显高于假手术组(P均<0.05)，且心梗并焦虑组GSDMD表达IOD值明显高于心梗组(P<0.05)；心梗并焦虑+中药组NLRP3、Caspase1、GSDMD表达IOD值均明显低于心梗并焦虑组(P均<0.05)，且NLRP3表达IOD值明显低于心梗组(P<0.05)。见图4～6。

图4 各组大鼠海马区NLRP3免疫组化检测情况

图5 各组大鼠海马区Caspase-1免疫组化检测情况

图6 各组大鼠海马区GSDMD免疫组化检测情况

2.6各组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1、GS-DMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平比较 心梗并焦虑组、心梗组、心梗并焦虑+中药组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显高于假手术组(P均<0.05)，且心梗并焦虑组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1、IL-18蛋白表达水平均明显高于心梗组(P均<0.05)；心梗并焦虑+中药组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显低于心梗并焦虑组(P均<0.05)，且NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18蛋白表达水平均明显低于心梗组(P均<0.05)。见图7。

图7 各组大鼠海马组织中NLRP3、Caspase1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达情况

3 讨 论

慢性空瓶刺激是诱导大鼠产生情绪应激的传统造模方式，也是焦虑模型大鼠的主要造模方法，简单易形。故本实验采用空瓶刺激方法进行焦虑造模，焦虑造模结束后采用高架十字迷宫实验和旷场实验进行行为学评测，脑部HE及尼氏染色进行病理形态学观察。结果显示，心梗并焦虑组大鼠进入开放臂次数比例、开放臂停留时间比例、鼠水平运动得分和垂直运动得分均明显低于假手术组和心梗组；脑部HE染色显示心梗并焦虑组大鼠海马区细胞发生核固缩，细胞数量减少，排列疏松，海马尼氏阳性面积减少。提示心肌梗死合并焦虑大鼠处在严重焦虑情绪状态中，脑部神经元受损严重。

目前研究认为炎性反应、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)激活和交感神经系统过度兴奋等是焦虑心理障碍诱发并恶化心血管疾病的病理机制。有研究表明，心肌梗死后机体处于应激性压力状态下，这种应激性压力激活了HPA轴和自主神经系统的交感分支(SNS)，伴随着迷走神经张力的降低，这种稳态失衡同时导致了焦虑抑郁的促炎状态[11]。SNS刺激导致促炎信号的上调，而副交感神经张力的降低会影响人体的免疫反应[12]。焦虑引起的交感神经系统及血小板活化是心肌梗死后并发症发生率增高的根本原因[13]。部分实验研究表明，心肌梗死后诱发焦虑样行为可能与小胶质细胞激活，神经元凋亡和海马氧化应激增强引起的炎症反应有关[14]。外周免疫炎性反应的激活可通过增加血清素的周转率和氧化应激反应，激活HPA轴以及降低突触可塑性来导致情绪和行为的改变[15]。本实验结果显示，心梗并焦虑组和心梗组大鼠海马区NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达IOD值和海马组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显高于假手术组，且心梗并焦虑组GSDMD表达IOD值和NLRP3、Caspase-1、IL-18蛋白表达水平均明显高于心梗组，提示处于焦虑状态下的心肌梗死大鼠海马区发生严重炎性反应。

柴胡加龙骨牡蛎汤源于《伤寒论》，方中柴胡疏解少阳之气郁，黄芩清泻少阳之郁热，柴胡和黄芩相伍，可使邪郁得透，气郁能达，火郁得清；龙骨、牡蛎、珍珠母(代铅丹)镇惊安神定志；茯苓宁心安神；大黄苦寒泻热，桂枝温通经络合大黄活血通络；半夏降逆化痰；人参益气安神扶正；生姜、大枣健脾益气，调和诸药；全方可安神解郁理气，有缓解焦虑抑郁作用，在临床中被广泛应用。本实验观察了柴胡加龙骨牡蛎汤对心肌梗死合并焦虑大鼠的影响，结果显示，心梗并焦虑+中药组大鼠进入开放臂次数所占比和开放臂停留时间所占比、大鼠水平运动得分和垂直运动得分、海马区尼氏阳性面积均明显高于心梗并焦虑组，海马区NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达IOD值和NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显低于心梗并焦虑组。提示柴胡加龙骨牡蛎汤可缓解心肌梗死合并焦虑大鼠的焦虑状态，抑制海马区细胞发生凋亡及炎性因子的释放。另外本研究超声心动图发现柴胡加龙骨牡蛎汤干预可改善心肌梗死合并焦虑大鼠的心功能。

综上所述，柴胡加龙骨牡蛎汤可能通过调控海马区NLRP3/GSDMD炎性信号通路，抑制心肌梗死合并焦虑大鼠海马区的炎性反应，缓解大鼠焦虑状态，且对心功能有一定积极影响，但仍需整合多方面的证据资料，进一步论证柴胡加龙骨牡蛎汤对心肌梗死合并焦虑的干预效应及机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。