环状RNA- 0007478 在急性心肌梗死患者中的预测价值

朱舟洋 翁雅雯 梁晓荷 黄周青 蔡雪黎 叶浡之

近年来，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已逐渐成为人类死亡的首要病因。在心肌梗死过程中，由于持续的心肌缺血引发细胞死亡，最终导致心功能不全和恶性心律失常，甚至心脏性猝死[1-2]。因此，早期诊断和充分评估对AMI 患者的救治及预防心肌进一步损伤至关重要[3]。典型的心电图表现和心肌坏死标志物如肌钙蛋白是诊断AMI的关键指标[2，4]。但部分超急性期AMI 患者可以不伴有典型心电图改变和肌钙蛋白的升高[5]，这类患者在临床中容易漏诊。环状RNA 是一类非编码RNA，它具有闭环结构，不易被核酸外切酶降解[6-7]，且在人细胞中广泛表达，在物种之间具有高度保守性[7-9]。这些结构特征提示，环状RNA 在疾病诊断方面具有潜在的价值。本文旨在研究AMI 患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量以评估其与冠状动脉病变严重程度的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2018 年7 月至12 月在温州医科大学附属第一医院行CT 冠脉造影（coronary angiography，CAG）的患者131 例，以胸痛为首诊症状，其中男84 例，女47 例，年龄36～90（64.3±11.6）岁。根据患者症状、心电图及CAG 结果分为AMI 组、不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）组和对照组。纳入标准：（1）AMI 组、UAP 组纳入标准：CAG 提示至少1 支主要血管狭窄≥50%，且分别由2 位不同术者根据美国心脏协会/ 美国心脏病学学会（AHA/ACC）指南冠状动脉数的分类确认；AMI 指持续胸痛＞20 min，心电图示相邻导联ST 段抬高/压低、伴心肌酶学/肌钙蛋白升高；UAP 指静息或低运动负荷下胸痛持续时间＞20 min，且近期（1 个月内）出现发作频率、持续时间改变及症状加重等，但不伴有肌钙蛋白I 或T 升高；（2）对照组纳入标准：既往无冠心病或卒中病史；心电图、心脏超声检查无异常，无急慢性肝肾疾病；CAG 提示阴性。排除标准：血流动力学不稳定者或心源性休克患者；严重肝功能衰竭，丙氨酸转氨酶≥正常3 倍以上者；明显自身免疫性疾病；未得到控制的甲状腺功能不全；恶性肿瘤；活动期的全身感染；孕妇、哺乳者；近3 个月内正在参加其他临床试验者；精神疾病患者；拒绝参加本研究患者。该研究方案通过本院医学伦理委员会批准（批准文号：YS2020 第108 号），所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 生化指标检测 入院时收集患者各项检查数据及既往病史。在行CAG 后立即采集患者静脉血，收集到乙二胺四乙酸管中，进行密度梯度离心，采用贝克曼库尔特AU5800 分析仪及其相关的试剂（美国贝克曼库尔特公司）检测血脂、血糖、肝肾功能等常规生化指标。

1.2.2 CAG 检测 由至少2 位具有丰富临床经验的介入科医生对患者进行多体位手术造影，然后由至少2 位高年资心血管医师根据CAG 结果仔细判读，评定冠状动脉每支病变血管的狭窄程度。根据CAG 结果分为AMI 组（具有典型胸痛且肌钙蛋白I升高，CAG 提示存在冠状动脉闭塞）72 例、UAP 组（有胸痛症状但心电图不典型，无肌钙蛋白I 升高，CAG 提示存在冠状动脉狭窄）28 例、对照组（有胸痛症状，CAG 阴性）31 例。

1.2.3 环状RNA-0007478 表达量检测 从患者外周血单个核细胞提取mRNA，经逆转录形成cDNA，利用qRT-PCR 检测环状RNA-0007478 的相对表达量。GAPDH 上游引物：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′；GAPDH 下游引物：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3；环状RNA-0007478 上游引物：5′-ATACATCTGCTGCCTACATTCC-3′ ；环 状 RNA-0007478 下游引物：5′-AGTCCCCAAGTACCAAGTGC-3′。采用美国Applied Biosystems 公司7300Plus仪器进行荧光定量PCR 反应，加入对应的cDNA 样本，每孔10 μL 的反应体系，PCR 循环程序设置为：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30s，72 ℃延长30 s，重复40 个循环。以人GAPDH 为外参，circRNA_0007478的相对表达量用2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct 目的基因-Ct外参基因。ΔΔCt=ΔCt 实验组-ΔCt 对照组。确定患者血清单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量。根据AHA/ACC 关于冠状动脉病变部位的标准[10]，AMI 组患者进一步分为近端血管病变者和远端血管病变者。根据心肌梗死发病持续时间，将AMI 组患者分为0～4 h 者（10 例），＜4～8 h 者（34例），＜8～12 h 者（16 例），＜12～24 h 者（8 例），＜24～72 h 者（4 例）。分析并比较不同部位血管病变者及不同心肌梗死发病持续时间者血清单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量。

1.2.4 Gensini 评分 Gensini 评分是根据冠状动脉狭窄程度来确定冠状动脉疾病的严重程度[11]，狭窄程度评估以动脉阻塞的25%划分，且包括冠状动脉的解剖位置。所有患者均按照标准技术进行定期CAG，至少有2 位经验丰富的介入心脏病专家对冠状动脉病变的严重程度进行评估。根据血管狭窄程度，无狭窄计0 分，1%～25%计1 分，26%～50%计2分，51%～75%计4 分，76%～90%计6 分，91%～99%计16 分，100%计32 分。根据病变血管的位置分配不同的权重系数。左主干计5 分，左前降支近端病变计2.5 分，左前降支中段病变计1.5 分，左前降支远端病变计1 分，左旋支中远段病变计1 分，右冠状动脉病变计1 分，小支病变计0.5 分。各血管分支Gensini 总分=狭窄程度评分×体重指数[12]。

1.3 统计学处理 采用Empower 软件（X & Y Solutions Inc，Boston，MA，USA;http://www.stats.com）和R 软件（http://www.Rproject.orgAQ3）。正态分布的计量资料以 表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组比较采用秩和检验；计数资料以百分率表示，多组比较采用χ2检验，组间两两比较采用χ2分割法。环状RNA-0007478 表达量与Gensini 评分的关系采用Pearson 相关。绘制ROC 曲线，评估环状RNA-0007478 预测AMI 的价值。采用多元线性回归分析患者冠状动脉狭窄严重程度的独立危险因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

表1 3 组患者一般资料比较

2.1 3 组患者一般资料比较 见表1。

由表1 可见，3 组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。AMI 组吸烟比例、白细胞、超敏C 反应蛋白、低密度脂蛋白胆固醇、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、脑钠肽、肌钙蛋白I、左心室射血分数均较对照组和UAP 组升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 3 组患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478的相对表达量比较 见图1。

由图1 可见，3 组患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 相对表达量差异有统计学意义（P＜0.01）。AMI 组环状RNA-0007478 相对表达量高于UAP 组和对照组（均P＜0.05），后两组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 AMI 组不同心肌梗死发病持续时间者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量比较 见图2。

图1 3 组患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量比较（与UAP 组比较，*P＜0.05；与对照组比较，**P＜0.01）

图2 AMI 组不同心肌梗死发病持续时间者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量比较（与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图2 可见，AMI 组中心肌梗死发病持续时间0～4 h、＜4～8 h 者，环状RNA-0007478 相对表达量较对照组差异均无统计学意义（均P＞0.05），＜8～12 h、＜12～24 h 者环状RNA-0007478 相对表达量均高于对照组（均P＜0.05），24 h 后，环状RNA-0007478 表达量下降，低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 冠心病危险因素对环状RNA-0007478 相对表达量的影响 见图3。

由图3 可见，环状RNA-0007478 相对表达量在非高血压患者和高血压患者、非高脂血症患者和高血脂症患者、非糖尿病患者和糖尿病患者、非吸烟患者及吸烟患者中比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 环状RNA-0007478 对AMI 预测价值的ROC曲线分析 见图4。

图4 环状RNA-0007478 对AMI 预测价值的ROC 曲线分析

图3 冠心病危险因素对患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 相对表达量的影响

由图4 可见，环状RNA-0007478 预测AMI 的曲线下面积为0.866，灵敏度为0.7966，特异度为0.7778，约登指数为0.5744，截断值为0.0005，这提示环状RNA-0007478 可作为AMI 发生的独立预测因子。

2.6 环状RNA-0007478 与Gensini 评分的相关性分析 见图5。

由图5 可见，AMI 组患者中，近端血管闭塞者49 例（68%），远端血管闭塞者23 例（32%）。近端血管病变患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478相对表达量为0.0008176±0.0000413，高于远端血管病变患者0.0005454±0.0000431（P＜0.01）。环状RNA-0007478 相对表达量与Gensini 评分呈正相关（r=0.493，P＜0.01）。

2.7 Gensini 评分的相关性分析及Gensini 评分与环状RNA-0007478 的多元线性分析 见表2、3。

图5 患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 相对表达量与Gensini 评分的相关性分析散点图

表2 Gensini 评分的相关性分析

表3 环状RNA-0007478 与Gensini 评分的多元线性分析

由表2 可见，Gensini 评分与心肌梗死危险因素的相关性分析中，吸烟史、低密度脂蛋白胆固醇、肌钙蛋白I、超敏C 反应蛋白、白细胞、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶水平均与Gensini 评分有相关性（均P＜0.05）。由表3 可见，在环状RNA-0007478 与Gensini 评分的多元线性回归中，模型分析调整了表2 中与Gensini 评分相关的因素，结果显示环状RNA-0007478 相对表达量与Gensini 积分具有独立相关性（β=5.27，95%CI：3.14～7.40，P＜0.01）。

3 讨论

AMI 发生的主要病理生理机制是冠状动脉粥样斑块破裂，而巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块进展中扮演重要角色。笔者前期通过环状RNA 芯片发现环状RNA-0007478 在氧化修饰的低密度脂蛋白刺激的巨噬细胞中表达显著上调（芯片数据详见GSE107522），而环状RNA-0007478 与AMI 之间的关系鲜有报道。

冠状动脉长时间闭塞可导致心肌坏死，在冠状动脉闭塞早期及时诊治可有效挽救受损的心肌，改善AMI 患者近期和远期的预后。目前，急诊经皮冠状动脉介入术和急诊冠状动脉旁路移植术的开展，有效降低了心肌梗死患者的死亡率[13]。但临床上仍有部分AMI 患者，特别是老年人，常常不能准确地描述胸痛症状，若存在心电图表现不典型，肌钙蛋白未明显或仅轻度升高，在未行CAG 的情况下需对AMI 进行鉴别诊断，同时这类患者又是极高危患者，早期诊断对提高这类患者的生存率至关重要[14]。此外，由于部分医院条件不足限制了临床医师对冠脉动脉狭窄疾病严重程度的判断。因此，如果能找到一种新的生物标志物既能在早期诊断AMI，又能反映冠状动脉狭窄的严重程度，这将对患者的诊疗带来便利。本研究发现在AMI 患者中环状RNA-0007478 的相对表达量明显升高，是AMI 发生的独立预测因子，且环状RNA-0007478 相对表达量与Gensini 评分呈正相关，即与AMI 患者冠状动脉病变的严重程度相关，有望成为用于诊断早期心肌梗死的生物学标志物。

研究发现，环状RNA 的异常表达与疾病的发生有关[15-17]。如环状RNA 在急性肾缺血再灌注损伤中发挥保护作用[18]。Cui 等[19]研究表明，在外周血单个核细胞中环状RNA-103636 的表达在诊断重度抑郁症方面具有潜在价值。环状RNA-CDR1as 作为微小RNA-7 的分子海绵，参与心肌梗死的发生[20]。本研究发现，AMI 患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量高于UAP 组和对照组，而后两组相比差异无统计学意义，这表明环状RNA-0007478 在AMI 患者中出现高表达。此外，本研究将心肌梗死发生时间分成5 个时间段，环状RNA-0007478 的表达量在心肌梗死发生的＜8～24 h表达升高，但在＜24～72 h 下降至正常水平，提示AMI 患者的环状RNA-0007478 相对表达量具有时间依赖性。ROC 曲线分析显示，环状RNA-0007478作为AMI 的标志物具有良好的诊断价值，并且具有较好的灵敏度和特异度。

患者的临床特征，如性别、吸烟、肥胖和糖尿病，是AMI 的危险因素，并可能影响其发病率[21]。众所周知，性别是心血管疾病的一个重要危险因素。由于身体激素的差异，男性通常比女性更早出现心血管疾病[22]。在本研究中，冠心病的危险因素如高血压、高血脂、糖尿病以及吸烟等并不影响环状RNA-0007478 的表达，这使得环状RNA-0007478的表达量有助于反映AMI 的病情。通过相关性分析显示环状RNA-0007478 与患者Gensini 评分呈正相关（r=0.493，P＜0.01），表明环状RNA-0007478 表达量与冠状动脉狭窄的严重程度存在相关性。为了纠正可能影响Gensini 评分的混杂因素，对性别、吸烟史、超敏C 反应蛋白、低密度脂蛋白胆固醇和白细胞进行了多元线性回归分析，结果显示环状RNA-0007478 与Gensini 评分具有独立相关性（P＜0.01）。在校正其他影响因素后，环状RNA-0007478表达上调1 个剂量单位，患者Gensini 评分提高5.27 分，故环状RNA-0007478 可作为预测冠状动脉病变严重程度的独立危险因素，其在冠状动脉病变的进程中发挥一定的作用。此外，本研究未纳入非冠状动脉闭塞的AMI 患者，因此本文的研究结论仅适用于冠状动脉闭塞的AMI 患者。

综上所述，冠状动脉闭塞的AMI 患者外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 的相对表达量升高，呈时间依赖性，是冠状动脉闭塞AMI 发生的独立预测因子。且环状RNA-0007478 表达与高血压、高血脂、糖尿病及吸烟无关，而与Gensini 评分呈正相关，反映了AMI 患者冠状动脉狭窄病变的严重程度。外周血单个核细胞中环状RNA-0007478 有望成为一种新的、可靠的诊断AMI 和预测冠状动脉病变严重程度的生物标志物。