用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中三组分的含量

吴 博，王铁柱，拜 年，刘 冰，宋洪涛 （. 新疆医科大学第一附属医院药剂科，新疆 乌鲁木齐 80000；. 新疆医科大学第四附属医院重症医学科，新疆 乌鲁木齐 80000；. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院药学科，福建 福州 5005）

市售复方酮康唑乳膏包含酮康唑、硫酸新霉素和丙酸氯倍他索，是治疗浅部真菌感染的常用药物。其中，酮康唑是最常用的抗真菌药物，具有价格低、抗菌谱广、抗真菌活性强等优势。但细菌对硫酸新霉素易产生耐药性，可导致患者反复感染，难以根治，且丙酸氯倍他索不适合12 岁以下儿童使用，副作用较多，可产生红斑、灼热、瘙痒等刺激症状，长期大面积用药可导致高血糖等[1-5]。针对上述问题，为改善市售产品的有效性和安全性，本课题组将硫酸新霉素替换为抗菌作用更强的莫匹罗星，将丙酸氯倍他索替换为副作用较少的糠酸莫米松，再结合酮康唑，制备新型复方酮康唑软膏，以提高患者的用药依从性[6-8]。

本研究采用反相高效液相色谱法同时测定复方酮康唑软膏中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松3 种药效成分的含量，该方法目前未见有文献报道。本法简便，灵敏，分离度好，准确性高，可以为该制剂的质量标准研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AL204 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1901 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Starter 2C 型实验室pH 计（奥豪斯仪器有限公司）；KQ-800KDE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

酮康唑对照品（批号：100294-201203，含量99.4%）、莫匹罗星对照品（批号：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松对照品（批号：100930-201201，含量99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；酮康唑原料药（批号：20130405）、莫匹罗星原料药（批号：20130301）、糠酸莫米松原料药（批号：20130228）均购自武汉鑫佳公司；聚乙二醇400 和聚乙二醇3 350（中国医药对外贸易公司）。

2 方法与结果

2.1 检测波长的确定

分别取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松适量，精密称定，加流动相制备成适宜浓度的溶液，以相应的溶剂为空白溶液，在190～400 nm 波长范围内进行紫外扫描，结果见图1。

图1 莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的紫外图谱

由图1 可见，莫匹罗星在220 nm 处具有最大吸收波长，糠酸莫米松在248 nm 处具有最大吸收波长，酮康唑在203 nm 和245.5 nm 具有最大吸收波长，三者在220 nm 与248 nm 之间均有吸收，因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20 倍，糠酸莫米松在220 nm 处响应值较小，为保证3 种药物能同时测定，确定酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的检测波长为248 nm。

2.2 色谱条件及系统适用性

色谱柱：Intersil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-pH5.5 磷酸盐缓冲液(65∶35)，柱温45 ℃，流速1.0 ml/min，检测波长248 nm，进样量10 μl。理论塔板数以各组分峰计，均不低于5 000，各色谱峰的分离度良好。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液

酮康唑对照品溶液：取酮康唑20 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，加入适量65%甲醇，超声使其完全溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到酮康唑的标准储备液，4 ℃低温避光保存。精密吸取酮康唑的标准储备液1 ml，置于10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

莫匹罗星对照品溶液：取莫匹罗星20 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，加入适量65%甲醇，超声使其完全溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到莫匹罗星的标准储备液，4 ℃低温避光保存。精密吸取莫匹罗星的标准储备液1 ml，置于10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

糠酸莫米松对照品溶液：取糠酸莫米松10 mg，精密称定，置100 ml 量瓶中，加入适量65%甲醇，超声使其完全溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，得到糠酸莫米松的标准储备液，4 ℃低温避光保存。精密吸取糠酸莫米松的标准储备液1 ml，置于10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

混合对照品溶液：取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的标准储备液各1 ml，置10 ml 量瓶中，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 供试品溶液

取复方酮康唑软膏0.5 g，精密称定，置于50 ml的容量瓶中，加65%甲醇适量，超声溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液

取空白软膏基质0.5 g，精密称定，置于50 ml的容量瓶中，加65%甲醇适量，超声溶解，加65%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得阴性对照溶液。

2.4 专属性考察

取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液分别按照上述色谱条件进样，记录色谱图及相关参数。莫匹罗星的保留时间为5.075 min，理论塔板数为9 196，对称因子0.81；糠酸莫米松的保留时间为18.413 min，理论塔板数为11 859，对称因子0.88；酮康唑的保留时间为23.318 min，理论塔板数为12 291，对称因子0.89，空白基质对莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的测定无干扰，方法专属性好。对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液色谱见图2。

图2 复方酮康唑软膏的RP-HPLC 色谱图

2.5 线性关系考察

分别精密吸取酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松标准储备液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml，置10 ml 量瓶中，用65%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件分别进样10 μl，记录色谱图峰面积。以峰面积A 对浓度C (μg/ml)进行线性回归，结果见表1。

表1 复方酮康唑软膏中主药的线性方程

2.6 重复性试验

分别精密量取同一批复方酮康唑软膏6 份，每份约0.5 g，按“2.3.2”项下操作，测定，计算酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松含量。结果见表2，结果表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24 h 进样10 μl 测定，计算不同时间点莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的含量，结果见表3。

2.8 回收率试验

分别精密称取莫匹罗星8、10、12 mg，糠酸莫米松0.4、0.5、0.6 mg，酮康唑8、10、12 mg（相当于标示量的80%、100%、120%），精密称定，分别置于0.5 g 的空白基质中，加适量流动相溶液，超声10 min 使溶解，置于50 ml 量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，得低、中、高不同浓度的溶液，每个浓度各3 份。用0.22 μm 微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液按上述色谱条件分别进样，记录色谱图峰面积。根据回归方程计算出相应浓度和含量，并计算回收率、平均回收率及RSD。结果见表4。

表2 复方酮康唑软膏中三种主药的重复性试验结果

表3 复方酮康唑软膏中三种主药的稳定性试验结果

表4 复方酮康唑软膏中三种主药回收率试验结果(n=3)

2.9 样品含量测定

取3 批样品，依法测定，结果见表5。

表5 3 批次样品含量测定结果(n=3，%)

3 讨论

3.1 提取方法的优化

本研究根据软膏剂的特性，选择了提取效率较高，操作简便的超声提取法进行样品前处理，对溶剂种类、溶剂体积、提取时间进行考察，最终选择65%甲醇50 ml，超声提取10 min，该提取方法可有效的除去样品中的杂质，让测定的专属性更高。

3.2 色谱条件的选择

对于流动相的选择，本实验尝试以甲醇-0.6%醋酸铵溶液作为流动相[9-12]，结果基线非常不稳定，这可能是由于醋酸铵的紫外吸收所造成。以甲醇-水、乙腈-水，甲醇-磷酸二氢钠溶液和甲醇-乙腈-水等作为流动相[13-15]，使用磷酸二氢钠溶液分离效果及峰形较好，有机相甲醇的比例应控制在一定范围，甲醇低于50%则酮康唑峰保留时间过长；流动相的酸度对酮康唑（弱碱性）和莫匹罗星（弱酸性）[16]的峰形及保留时间亦有影响，用磷酸将磷酸二氢钠的pH 值调节到4.5、5.0、5.5 和6.0。结果表明，当流动相的pH 值为5.5 时，莫匹罗星、糠酸莫米松和酮康唑的三组峰值均具有较好的分离度，并且无前延和拖尾现象。对于检测波长的选择，酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松在220 nm 与248 nm均有吸收，因在供试品中酮康唑和莫匹罗星的浓度均是糠酸莫米松的20 倍，为了让这三种药物能同时测定，提高检测的灵敏度，确定最佳检测波长为248 nm。对于色谱柱的选择，本研究考察了岛津、安捷伦和沃特世等品牌的色谱柱，最终选择了岛津Intersil ODS-3 柱，三种待测成分在该柱上分离度好，峰形佳，所以确定为最佳色谱柱。

3.3 含量测定结果分析

3 个批次的复方酮康唑软膏均为实验室自制，从测定结果可以看出，不同批次的样品中酮康唑、莫匹罗星和糠酸莫米松的含量有一定波动，这提示我们在进行中试放大生产时，要充分考虑各因素的影响，保证制剂中主要成分的含量稳定，同时对软膏剂的长期稳定性也需要进行考察。