不同鸟嘌呤碱基数目对DNA/银纳米簇荧光强度的影响

袁一凡，陆 峰 （海军军医大学药学院药物分析学教研室，上海 200433）

荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指供体荧光分子发射光谱与受体分子的吸收光谱有显著的重叠且分子间距小于10 nm 时发生的一种非放射性的能量转移[1]，导致供体荧光淬灭而受体荧光增强或不变。近些年，FRET 技术以其精准高效的特点被广泛应用在分析检测领域，为检测生物分子提供了重要的分析方法。基于FRET 技术，实现了活细胞内ATP 分子的检测[2]，金属离子如汞离子的检测[3-4]，许多疾病相关基因[5-6]以及酶活性的检测等[7-8]。

银纳米簇（AgNCs），作为一种新型的低毒性“绿色”荧光标记材料，具有量子产率高、毒性低、生物相容性好等特点[9]，使得其被广泛应用在多个研究领域。在银纳米簇的合成过程中，相较于其他的合成模板，DNA 更具优势，如DNA 具有分子识别的功能（包括对于互补链和小分子的识别），不同序列的DNA 模板可调谐不同的发射波长等[10]。

研究发现，G 碱基可以增强DNA/银纳米簇（DNA/AgNCs）的荧光强度[11-12]，基于此，我们设计了系列非银簇模板部分的互补链，考察G 碱基个数对于银簇荧光强度的影响，实验结果显示，暴露的G 碱基个数与银簇的荧光强度呈正相关关系。该实验不仅验证了G 碱基对于银簇荧光的增强作用，还提示我们在设计含有G-四联体适配体的荧光探针时，可通过改变非银簇部分的互补链长短来调控荧光的淬灭及恢复程度，以获得最佳的检测效果。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

VS-100C 恒温混匀仪（无锡沃信仪器制造有限公司）；FL-6500 荧光分光光度计（PerkinElmer）；ZEN3600 粒径电位测定仪（英国马尔文公司）；精密电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Vortex-Genie2 多功能旋涡混合器（美国Scientific Industries 公司）；TGL-16C 离心机（上海安亭科学仪器厂）；实验室pH 计 FE20[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Tecnai G2 F30 高分辨率电子显微镜（荷兰FEI 公司）

1.2 试剂

硝酸银、硼氢化钠、盐酸(国药集团化学试剂有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，大连美仑生物技术有限公司)；氯化镁、氯化钠、氯化钾(上海泰坦科技股份有限公司)；试剂均为分析纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水。

相关DNA 序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成DNA-AgNCs 的模板序列及P1A5C5 的互补序列如表1、表2 所示。

表1 DNA/AgNCs 的模板序列

表2 P1A5C5 的互补序列

2 实验内容

2.1 DNA 溶液的配制及处理

加入相应体积的20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.4）缓冲溶液将DNA 溶解，即制得100μmol/L DNA 溶液，将制得的DNA 溶液95 ℃加热5 min 后，冰水浴冷却10 min。

2.2 银纳米簇的制备

参考文献中的合成方法[13]，将一定体积的硝酸银溶液加入到上述DNA 溶液中（20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4），充分震荡混匀，25 ℃孵育20 min，静置，将一定体积新配制的硼氢化钠引入到上述反应混合物中，最终使得体系中DNA、硝酸银、硼氢化钠的浓度分别为5、30、30μmol/L（即DNA：Ag+∶NaBH4的摩尔比为1∶6∶6），剧烈震荡混匀，室温下避光反应3 h 后，4 ℃避光反应过夜。得到的银纳米簇溶液在4 ℃保存以备用。

2.3 银纳米簇的表征

荧光图谱表征：将2μmol/L 的银纳米簇溶液在200～800 nm 波长范围内进行荧光光谱预扫描，设置激发和发射狭缝宽度为10 nm，扫描速度为1 200 nm/min，电压值为400 V。

高分辨率透射电子显微镜表征：将银纳米簇溶液滴加铜网后观察。

2.4 荧光光谱测量

在含有100 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl 的20 mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液中（pH=7.4），加入银簇溶液（2μmol/L），将互补的DNA 溶液（表2）以1∶1 的摩尔比分别加入到上述体系溶液中，充分震荡混匀，37 ℃孵育20 min。在室温条件下进行荧光光谱测量。激发波长为486 nm，激发和发射狭缝宽度为10 nm，扫描速度为1 200 nm/min，电压值为400 V。

3 结果与讨论

3.1 银纳米簇的合成与表征

在进行DNA/AgNCs 的合成时，基于胞嘧啶碱基与银离子的作用，一般选择富含胞嘧啶碱基的序列作为合成模板，笔者根据文献报道的模板序列结合模板优化设计[13-16]，选择了5 种银簇模板并进行了相应的碱基优化设计，如表1 所示，结果显示P1A5C5 的荧光信号强度较高（如图1），且4 ℃避光保存45 d 后，荧光信号强度基本不变，稳定性良好。因此，我们使用该序列合成的DNA/AgNCs 进行后续的实验研究。

对生成的P1A5C5 银纳米簇体系进行荧光激发光谱和发射光谱的表征，结果如图2 所示，在487 nm 激发条件下，发射波长为577 nm。

DNA/AgNCs 的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）图片如图3 所示，从图中可以看出，DNA/AgNCs 的直径约为2～3 nm,分散性良好。

图1 5 种DNA/AgNCs 模板序列的荧光图谱表征

图2 P1 A5 C5 银纳米簇的荧光图谱表征

图3 DNA/AgNCs 的高分辨率透射电子显微镜图

图4 P1 A5 C5 与互补链作用后的荧光光谱图及线性关系图

3.2 互补DNA 的设计及荧光响应情况

在银簇P1A5C5 序列5′-GGAGGTGGTGGGG AAAAACCCCCTAATTCCCCC-3′中，CCCCCTAA TTCCCCC 为成簇模板序列，下划线部分为岩沙海葵毒素的G-四联体适配体[17]。基于G 碱基对银簇的荧光信号强度有增强作用这一现象，我们设计了一系列适配体部分的互补序列（表2），通过C-G 碱基互补，适配体部分暴露的G 碱基个数不同，导致与银纳米簇作用的碱基G 数目不同，进而对银纳米簇的荧光信号强度产生不同的影响。结果显示，随着暴露的G 碱基个数的增加，荧光信号强度增加（图4A），对暴露的G 碱基个数与荧光信号强度关系进行拟合，得到的线性方程为：Y=1 726.1X+8 972.5，r=0.978 9（图4 B）。该研究证明了G 碱基对银簇的荧光具有增强效果，反之，通过C-G 碱基互补配对，G 碱基与银簇的作用位点被占据，无法与银簇作用，难以达到增强荧光信号强度的作用。因此，随着暴露碱基个数的减少，荧光强度减弱。基于此，可实现与G-四联体适配体有关的荧光开关的设计，进而实现对目标物的检测。

在DNA 序列和银纳米簇进行碱基互补配对时，结合互补序列的Tm 值，我们研究了互补链间实现碱基互补配对所需的温度和时间。实验结果显示，相较于4 ℃，在37 ℃条件下孵育，互补链间相互作用较强，容易实现碱基互补配对，荧光信号强度变化较为明显；同时，考察了在37 ℃下作用1 h内的荧光变化情况，结果显示，荧光变化强度随时间未发生明显变化，最终选择20 min 作为孵育时间。

4 结论

该实验利用含有G 四联体适配体的DNA 序列合成了荧光银纳米簇，基于G 碱基可以增强银纳米簇的荧光这一现象，并结合碱基互补配对的原则，设计了8 种G 四联体适配体的互补链，在互补链和适配体部分碱基互补配对后，荧光信号强度也产生相应的变化。随着互补链长度的缩短，暴露的G 碱基个数增加，荧光信号增强，且暴露的G 碱基个数与荧光信号强度拟合得到的线性方程为：Y=1 726.1X+8 972.5，r=0.978 9。该实验不仅证实了G碱基对荧光银纳米簇有荧光增强作用，还提示我们在设计含有G 四联体的银纳米簇荧光探针时，可以通过互补链对荧光信号的干扰程度来调控荧光的开闭，这对进一步扩展银纳米簇在荧光分析方法中的应用具有指导意义。