小兴安岭3种原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落特征

陈秀波，段文标，陈立新，朱德全，赵晨晨，刘东旭

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.贵州财经大学艺术学院，贵州 贵阳 550025；3.佳木斯大学理学院，黑龙江 佳木斯 154007；4.佳木斯大学中-乌农林技术开发与应用国际联合实验室，黑龙江 佳木斯 154007)

红松(Pinuskoraiensis)是我国东北地区的珍贵针叶树种，以红松为主的混交林是本地区地带性顶极群落，具有极高的生产力和生态地位。同时该区域存在岛状永久性冻土，属于全球气候变化敏感区域[1]。19世纪初开始，大量原始红松被砍伐，除少数保护区外原始红松林已基本消失[2]，保护和维持红松林生态系统稳定成为学界关注的重点。

红松作为温带地区顶极群落红松混交林的建群种，在红松幼苗更新、次生演替、通过竞争达到顶级群落的过程中，反硝化微生物在土壤氮素循环过程中发挥着重要作用。研究不同原始红松林土壤反硝化微生物群落结构和多样性，有助于了解原始红松林土壤的氮循环过程。然而，目前采用功能基因研究原始红松林土壤中的反硝化微生物群落特征及其与土壤理化性质之间相互关系鲜见报道。为此，本研究以位于黑龙江省伊春市带岭区凉水国家级自然保护区内的3种典型原始红松混交林(云冷杉红松林、椴树红松林和枫桦红松林)的林下土壤为对象，以反硝化功能基因nirK为分子靶标，采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对比分析3种林型下土壤的nirK型反硝化微生物群落结构和多样性特征，通过冗余分析探索影响原始红松林土壤nirK型反硝化菌群的关键土壤理化因子，从而为深入了解不同原始红松林土壤的反硝化潜势和氮循环过程提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究样地位于黑龙江省伊春市带岭区境内的小兴安岭凉水国家级自然保护区(128°53′20″E，47°10′50″N)，样地基本信息见表1。

表1 小兴安岭3种原始红松林样地基本信息Table 1 Basic information of sampling sites of three types of primitive Pinus koraiensis forest of Lesser Khingan Mountains

研究区域地带性植被类型是以红松为主的混交林，土壤为山地暗棕色森林土。该区域具有明显的温带大陆性季风气候特征，春季来临迟缓，降水较少；夏季短促，降雨集中在6—8月，占全年降水量的60%以上。气温较高，秋季降温快；冬季漫长，多风雪，严寒干燥。年平均气温只有-3 ℃，年平均地温1.2 ℃，年平均降水量667 mm，年平均相对湿度78%。在该区域内，选取3种典型原始红松林[云冷杉红松林(编号A)、椴树红松林(编号B)和枫桦红松林(编号C)]，坡位为阳坡，坡向均为西南方向。每种林型设置4块面积为25 m×25 m的样地。对所有样地的优势乔灌木进行每木检尺和植物调查，3种原始林中的藤本植物主要为狗枣猕猴桃(Actinidiakolomikta)和忍冬(Lonicerajaponica)。草本植物主要以鳞毛蕨(Dryopterisspp.)、东北蹄盖蕨(Athyriumbrevifrons)和蚊子草(Filipendulapalmata)为主。

1.2 土壤样品采集和理化因子的测定

根据森林土壤分析方法测定土壤理化性质[17]。使用Delta 320 pH计(梅特勒-托利多公司)测定土壤pH；采用环刀法测定土壤容重和土壤孔隙度；采用烘干法测定土壤含水量，凯氏定氮法测定全氮含量[17]；采用重铬酸钾氧化法测定有机碳含量[18]；采用钼锑抗比色法测定全磷含量[19]；采用酚二磺酸比色法测定硝态氮含量[20]；采用靛酚蓝比色法测定铵态氮含量[17]。

1.3 土壤微生物DNA提取、nirK基因扩增和测序

称取0.5 g土样，采用Fast©DNA SPIN Kit (MP Biomedicals,CA,USA)提取土壤微生物的总DNA，然后采用PowerClean©DNA Clean-up Kit (MoBio,CA,USA)对提取的DNA进行纯化，测定其浓度及纯度后，置于冰箱中-20 ℃保存。采用引物nirK-F(TCATGGTGCTGCCGCGYGANGG)和nirK-R(GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC)扩增nirK基因的高变区片段[21]。PCR反应按试剂盒说明书进行操作。PCR反应后用2%琼脂糖电泳检测PCR产物，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。利用Quant-iTPico Green dsDNA Assay Kit (Invitrogen,USA)对PCR产物在Microplate reader (FLx800,BioTek)上进行定量，然后按照每个样品所需的数据量进行混样，构建Miseq文库。采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(Illumina,USA)制备测序文库。依据PCR产物浓度，将所有扩增成功的PCR产物等量混合，采用Illumina Miseq平台进行双末端250 bp测序。数据下机后，去除reads接头和barcode序列，同时采用FLASH软件对原始序列进行质控和过滤，去除低质量序列，并采用Usearch软件(Vsesion 7.0，http://drive5.com/uparse/)去除嵌合体序列，并对处理得到的高质量序列进行统计。

1.4 数据处理及生物信息学分析

采用QIIME软件，调用UCLUST序列比对工具[22]，对获得的高质量序列，按97%的序列相似度进行OTU(operational taxonomic units)划分和归并，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列。随后，根据每个OTU在每个土壤样本中所包含的序列数，构建OTU在各样本中丰度的矩阵文件(即OTU table)。将丰度值低于全体样本测序总量0.001%的稀有OTU去除，去除稀有OTU和抽平后的OTU丰度矩阵用于后续分析。

采用QIIME软件将OTU的代表序列与功能基因数据库(FunGene)(http://fungene.cme.msu.edu/)进行比对，获取每个OTU对应的分类学信息。根据OTU划分和分类地位鉴定结果，使用QIIME软件，获得每个样本在各分类水平(界、门、纲、目、科、属、种)的具体组成。利用QIIME软件计算每个样本的4种α多样性指数(Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数)。使用QIIME软件，采用Bray-Curtis距离算法进行样本层级聚类树分析，使用R软件进行可视化。同时通过R软件，对3种林型的nirK型反硝化微生物群落进行ANOSIM(analysis of similarities)分析，判断样本组内和组间差异大小。用Mothur软件，调用Metastats统计学算法[23]，各林型之间绝对丰度在门和属水平上两两比较检验，找出差异显著的20个分类单元。应用SPSS 16.0软件进行土壤理化性质和α多样性指数的差异显著分析。采用CANNOCO 5.0软件进行优势反硝化微生物和土壤理化性质的冗余分析。采用Spearman相关性检验，分析优势反硝化微生物和土壤理化性质的相关性，并采用R软件绘制相关性热图。

2 结果与分析

2.1 不同林型原始红松混交林土壤理化性质

经测定发现，3种原始红松混交林的土壤理化因子中，pH、总有机碳、土壤容重没有显著差异，铵态氮和硝态氮含量在各林型之间均有显著差异(表2)。

表2 小兴安岭3种原始红松混交林土壤理化性质Table 2 Physicochemical properties of soil in three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains

2.2 不同林型原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落组成及丰度差异

采用Miseq测序技术对微生物nirK基因进行测序分析，12个土壤样品共测得原始序列848 312条，优质序列761 912条，长度分布在173～452 bp，平均长度320 bp。样品经过滤、拆分、去冗余后在按97%的相似度下进行OTU分析和聚类，共得到16 939个OTUs。所有优质序列经比对鉴定得到3界(细菌、古菌和无明确分类地位)6门、8纲、10目、13科、18属、29种的土壤nirK型反硝化微生物分类学信息。3种林型土壤nirK型反硝化微生物在门和属水平上的群落组成见图1。

图1 小兴安岭3种林型原始红松混交林4样地土壤的nirK型反硝化微生物门(a)和属(b)分类Fig.1 The soil nirK type denitrifying microorganisms in four sampling plots of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains on Phylum(a)and Genus(b) level

在门分类水平上(图1A)，3种林型土壤nirK反硝化菌群中含有大量分类地位不明确的微生物，组成比例在37.1%～59.6%。而在有注释的微生物中，3种林型均以变形菌门(Proteobacteria)为主，其相对丰度分别为30.9%～53.9%。变形菌门的组成比例在椴树红松林土壤中最高(53.9%)，但在枫桦红松林中比例最低(30.9%)。同时在3种林型中还含有少量的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)。它们在各林型土壤中的组成比例在0.2%～0.9%。另外，在云冷杉红松林和椴树红松林土壤中还含有少量拟杆菌门(Bacteroidetes)以及仅在椴树红松林中含有不足0.02%的厚壁菌门(Firmicutes)。采用Metastats分析进一步确定不同原始红松林之间丰度显著差异的nirK型反硝化微生物(图2)，在门水平上各林型之间丰度显著性差异的物种有3个：拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)和变形菌门(Proteobacteria)(图2a、2b、2c)。云冷杉红松林和椴树红松林土壤中nirK型反硝化微生物在门水平上丰度没有显著性差异，云冷杉红松林和枫桦红松林土壤中nirK型反硝化微生物中广古菌门和拟杆菌门丰度差异显著(P<0.05)，椴树红松林和枫桦红松林土壤nirK型反硝化微生物中变形菌门丰度差异显著(P<0.05)。

图2 小兴安岭3种原始红松混交林土壤中nirK型反硝化微生物门水平和属水平的丰度显著差异Fig.2 Soil nirK-type denitrifying microorganisms of three types of Pinus koraiensis mixed forest with significant difference of abundance at Phylum level and Genus level of Lesser Khingan Mountains

在属水平上，取所有样本中平均相对丰度前20位的菌群，将未鉴定和剩余的所有分类单元都归为“other”后作图，观察不同林型土壤nirK型反硝化群落分布变化情况(图1b)。结果表明：在各样本中，未知菌属同样占很大比例，在鉴定的已知菌属中，组成比例在2%以上的菌属有慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、固氮螺菌属(Azospirillum)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、无色杆菌属(Achromobacter)。其中慢生根瘤菌属为核心菌属，在各林型中组成比例在15%以上，云冷杉红松林土壤中最高(30.6%)，枫桦红松林土壤中最低(15.7%)。其他相对丰度大于0.3%的菌属有Ralstonia属，假单胞菌属(Pseudomonas)、马赛菌属(Massilia)、Melaminivora属、中生根瘤菌属(Mesorhizobium)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、叶杆菌属(Pleomorphomonas)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、中华根瘤菌属 (Sinorhizobium)等。

在属水平上3种原始红松混交林样地中nirK型反硝化微生物丰度显著差异的物种有10个(图2b—2m)：微枝形杆菌属(Microvirga)、嗜盐杆菌属(Halobacterium)、叶杆菌属(Pleomorphomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、Salinigranum属、藤黄单胞菌属(Luteimonas)、Melaminivora属、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁菌属(Brucella)。其中微枝形杆菌属、嗜盐杆菌属、叶杆菌属、无色杆菌属在云冷杉红松林和椴树红松林中丰度差异显著(P<0.05)；无色杆菌属、叶杆菌属、中华根瘤菌属、Salinigranum属、嗜盐杆菌属、藤黄单胞菌属、Melaminivora属、慢生根瘤菌属在云冷杉红松林和枫桦红松林中丰度差异显著(P<0.05)；然而，椴树红松林和枫桦红松林土壤中，只有布鲁菌属丰度存在显著差异(P<0.05)。其中，3种林型土壤中nirK型反硝化微生物组成比例最高的核心菌属——慢生根瘤菌属丰度以云冷杉红松林最高，椴树红松林次之，枫桦红松林最低，并且在云冷杉红松林和枫桦红松林之间差异显著(P<0.05)。

2.3 原始红松混交林土壤反硝化微生物群落的多样性分析

3种原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物α多样性指数的统计结果见表3，可以看出3种林型的α多样性指数无显著差异。

表3 小兴安岭3种林型原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物的α多样性指数Table 3 Alpha diversity index of soil nirK-type denitrifying microorganisms in three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains

图3 小兴安岭3种林型原始红松混交林样地土壤nirK型反硝化微生物基于Bray-Curtis距离算法的样本层级聚类树Fig.3 Hierarchical clustering tree of soil nirK-type denitrifying microorganisms in four sampling plots of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains based on Bray-Curtis

基于Bray-Curtis距离算法对3种林型土壤nirK型反硝化微生物群落进行样本层级聚类分析，结果见图3。由图3看出，椴树红松林和枫桦红松林中土壤nirK型反硝化微生物群落相互交集，不能完全分开，表明椴树红松林和枫桦红松林差异性较小，但它们都与云冷杉红松林的样本距离较远，表明云冷杉红松林的土壤nirK型反硝化微生物群落与椴树红松林和枫桦红松林差异性较大。采用基于Bray-Curtis距离算法的Anosim分析对组间群落相似性进行非参数检验，结果显示：3种原始红松林土壤nirK型反硝化微生物群落组成差异显著(R=0.25，P<0.05)，其中云冷杉红松林与椴树红松林、枫桦红松林之间差异均显著(P<0.05)，但椴树红松林和枫桦红松林土壤nirK型反硝化微生物组成相近，差异不显著(P>0.05)，这与样本层级聚类树分析结果类似。

2.4 原始红松混交林土壤反硝化微生物群落与土壤理化因子的关联分析

WC.土壤含水量 soil water content；TOC.总有机碳 total organic carbon；TN.全氮 total nitrogen；TP.全磷total phosphorus；TOP.总孔隙度soil porosity；SBD.土壤容重soil bulk 硝态氮nitrate 铵态氮ammonium nitrogen。下同。The same below.图4 小兴安岭3种林型原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落与土壤理化因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis(RDA)between soil physicochemical factors and soil nirK-type denitrifying microorganisms community of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains based on Bray-Curtis

采用冗余分析(redundancy analysis,RDA)探究影响3种原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落组成的环境因子。选择9个对微生物群落有影响的土壤理化因子(pH、水分含量、土壤总孔隙度、土壤容重、有机质、全氮、全磷、铵态氮和硝态氮)结合OTUs表格进行分析。结果表明，铵态氮和全氮含量是显著影响3种原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落组成的主要理化因子(P<0.05)。同时根据各理化因子在第一轴的投影显示，铵态氮含量可能是影响3种原始红松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落组成的主要理化因子，其次为全氮含量(图4)。采用Spearman相关性系数分析3种林型不同土壤理化因子与土壤nirK型反硝化微生物群落组成的相关性，丰度前20菌属的相关性热图见图5。由图5看出，土壤nirK型反硝化微生物群落与土壤理化因子的相关性情况存在差异。其中与铵态氮含量呈显著相关的菌属最多达7个，分别是慢生根瘤菌属、红假单胞菌属、无色杆菌属、伯霍尔德杆菌属、土壤杆菌属、中华根瘤菌属、Gramella属。其次是硝态氮、全氮和总有机碳，与它们显著相关的菌属各有3个。

图5 小兴安岭3种林型原始红松混交林土壤理化因子和nirK型反硝化微生物群落相关性热图Fig.5 Correlation heatmap of soil physicochemical factors and soil nirK-type denitrifying microor-ganisms community of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains

3 讨 论

3.1 森林土壤nirK型反硝化微生物的群落结构和多样性

反硝化微生物广泛分布于细菌和古菌中[8]，也发现部分真菌线粒体中有反硝化作用[8]。本研究发现3种原始红松林土壤中参与反硝化作用包括细菌和古生菌，还发现许多未明确鉴定的nirK基因序列，在原始红松林土壤中是否有反硝化作用的真菌，还需要对这些未知物种的nirK基因序列进一步分析鉴定。在已有分类地位的nirK型反硝化微生物中，3种原始红松林的土壤中nirK型反硝化微生物主要以变形菌门为主，变形菌门的组成比例在椴树红松林土壤中最高，然而在枫桦红松林中比例最低。研究发现，变形菌门的分布包括α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲，与Hou等[24]在施肥土壤中的研究结果类似，但在该研究中鉴定的nirK型反硝化微生物包括α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲。在属水平上，组成比例在2%以上的菌属有慢生根瘤菌属、红假单胞菌属、固氮螺菌属、伯霍尔德杆菌属、无色杆菌属，其中慢生根瘤菌属为核心菌属。但此次得到的nirK型反硝化菌群信息比以往更丰富[10,25]。

本研究发现3种林型土壤中nirK型反硝化微生物α多样性指数无显著性差异，这与已有研究结果一致[26-29]。如施肥[28-29]、土壤理化性质的差异[26-27]和土壤管理方式的改变[10]未对nirK型反硝化微生物α多样性指数产生显著性影响。这是因为土壤nirK型反硝化微生物α多样性与森林中优势植物种类有关[30-31]。这可能是不同植物的微环境土壤中nirK型反硝化微生物群落差异所致。同样Barta等[32]报道，nirK型反硝化细菌在酸化的挪威云杉林土壤中更丰富。由于3种林型优势乔木均为红松，伴生植物的不同导致了3种林型部分土壤理化性质的差异，如铵态氮和硝态氮。这些理化性质的差异虽未对其α多样性产生显著性影响，但导致了β多样性显著差异，其中土壤铵态氮含量是影响3种林型nirK型反硝化微生物群落组成的主要理化因子，全氮含量其次。

3.2 森林土壤nirK型反硝化微生物群落结构的影响因素