33个杨柳品种指纹图谱构建

何旭东，郑纪伟，孙 冲，何开跃，王保松*

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153;2.江苏省农业种质资源保护与利用平台柳树资源圃，江苏 南京 211153;3.南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037)

杨树与柳树同属于杨柳科(Salicaceae)，是我国重要的速生用材、园林绿化与生态防护树种，广泛用于制浆造纸、胶合板、纤维板、家具制品等。在北美与欧洲，杨树和柳树还作为可持续种植的、优质的生物能源[1-2]与生物修复[3-4]材料被大面积推广与应用。目前，我国杨树人工林面积已突破800万hm2，居世界首位，超过其他国家杨树人工林面积总和。仅江苏实施“绿色江苏”工程10 a以来，杨树人工林栽植面积最高峰时达到100万hm2。而江苏省林业科学研究院选育的20余个不同用途的‘苏柳’系列柳树优良品种，已在我国东北、西北、华北、华东及长江中下游地区26个省(市、区)推广，取得了显著的经济、生态和社会效益。

近年来，随着造林面积的不断扩大，杨树、柳树的优良品种的选育与推广也发展迅速。但杨树、柳树的品种间形态极为相似，仅从表型性状难以对插穗或在苗期进行品种间的区分，各产区间相互引种时经常造成品种混淆，且杨树与柳树无性繁殖简单，部分种苗经营者由于利益驱动甚至故意造假，给造林生产带来极大的损失。因此，建立一种快速、高效、稳定、可靠的杨树、柳树品种鉴定体系尤为重要，不仅有助于不同地域间优良品种的推广，而且还能保护品种所有权人的权益，规范种苗生产经营，引导种苗产业健康发展。

分子标记可直接反映个体DNA水平上的差异，不受环境与季节的影响，过程简便且结果可靠，可有效弥补依据表型性状进行品种鉴定的不足。众多分子标记中，微卫星(microsatellite)标记因其数量众多、分布广泛、共显性与重复性好、通用性高，已广泛应用于如杨树[5-6]、桉树[7-8]、胡桃[9]、油橄榄[10]、荔枝[11]、茶树[12]、海棠[13]、桂花[14]等多个木本植物的品种鉴定与指纹图谱构建研究。随着杨树与柳树多个树种全基因组测序相继完成[15-18]，大量的基因组信息被陆续公布，同时基于转录组测序也开发出了众多的杨树与柳树EST-SSR标记[19-20]，为杨树与柳树遗传学与基因组学的研究提供了现成的可用资源。相比杨树而言，国内柳树分子生物学研究起步较晚，在利用SSR标记技术进行品种鉴定与指纹图谱构建方面仅见王源秀等[21]对杞柳和簸箕柳杂交亲本进行DNA指纹图谱分析的报道。鉴于此，本研究利用前期基于垂柳和簸箕柳转录组测序开发的EST-SSR标记进行杨树和柳树种间通用性检测，并利用荧光标记分型技术构建33份杨树和柳树优良品种的指纹图谱，以期为杨树与柳树优良品种的鉴定、保护与推广工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及引物筛选

本研究试验材料包括21个柳树品种和12个杨树品种，共计33份材料(表1)。除竹柳(编号13)和8个美国引进的商业品种(编号14-21)外，其余品种均为国家或省级认(审)定的良种。所有材料均定植于江苏省林业科学研究院种质资源圃内。

采集所有参试个体幼嫩叶片，DNA提取方法参考郑纪伟等[22]的方法。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Nanodrop检测DNA质量与浓度，-20 ℃保存备用。

从前期已发表的柳树EST-SSR标记中随机挑选通用性较高的38对引物[20]，并以所有杨树与柳树品种为模板进行标记初筛，最终确定12对EST-SSR标记用于指纹图谱构建(表2)。

PCR为10 μL反应体系，包含Buffer 1 μL，dNTPs 0.025 μL，Taq酶0.1 μL，Mg2+0.6 μL，前后项引物各0.5 μL，DNA模板 1μL，ddH2O 6.27 5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 试验材料Table 1 Experimental materials

表2 12对EST-SSR引物信息Table 2 Details of 12 EST-SSR primer pairs

表2(续)

1.2 基因分型

利用荧光dUTP(Fermentas Inernational Inc.,Burlington,Canada)法进行基因分型。PCR为10 μL反应体系，加入0.01 μL dUTP，总体积不变，扩增程序为touch-down：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，66 ℃→56 ℃退火(每个循环降低0.5 ℃)30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26个循环；72 ℃延伸10 min。

取2 μL PCR反应产物并按体积比1∶4加入缓冲液稀释(7.82 μL高纯甲酰胺+0.18 μL GeneScan 500 LIZ)，95 ℃变性5 min后迅速置于冰上冷却，放入ABI 3130测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上进行毛细管电泳检测。基因分型按软件GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems)中的Standard Module进行。

1.3 数据分析

利用Excel统计各位点等位基因数、等位片段大小，并按以下公式计算各位点多态信息含量(polymorphism information content，PIC)。

式中：CPIC为各位点多态信息含量，n为EST-SSR标记检测到的等位基因数量总和，Pi为第i个等位基因的频率。按多态性条带的有无将等位基因转化为0/1矩阵并计算SM相似性系数，利用NTSYS-pc version 2.1按UPGMA法对33个品种进行聚类。

2 结果与分析

2.1 标记通用性分析

利用38对基于垂柳和簸箕柳开发的EST-SSR标记在杨树和柳树品种中进行扩增，其中26对在所有柳树品种中均能扩增成功，通用性为68.4%，22对能在杨树品种中扩增成功，通用性为57.89%。从中选择12对多态性较好的标记用于下一步基因分型与指纹图谱构建。

2.2 标记多态性分析

对EST-SSR标记多态性的检测结果(表3)表明，12个EST-SSR标记共扩增出97条等位片段，每个位点等位基因数5～13个不等，平均为8.1个。其中位点SALeSSR0346扩增的等位基因数最多，为13个；位点SALeSSR0279扩增的等位基因数最少，为5个。12个EST-SSR标记的PIC变化范围为0.637 2(SALeSSR0108)～0.834 8(SALeSSR0296)，平均为0.781 7。图1为SALeSSR069标记在部分品种中的基因分型结果。

表3 13对EST-SSR标记多态性检测Table 3 Polymorphism detection of the 13 pairs of EST-SSR markers

图1 SLAeSSR069标记在部分品种中的基因分型Fig.1 Genotyping by SLAeSSR069 marker for partial varieties

2.3 指纹图谱构建

对12个EST-SSR位点的等位片段进行进一步分析，从中挑选出3对核心引物用于构建指纹图谱(表4)。其中，引物SALeSSR0346可以区分13个品种，引物SALeSSR0340能区分6个品种，引物SALeSSR0259能区分7个品种。通过引物SALeSSR0346与SALeSSR0340的组合即可完全区分12个杨树品种，而通过增加引物SALeSSR0259的组合即可完全区分包含柳树在内的所有33个品种。

表4 33个杨树与柳树品种的指纹图谱Table 4 Fingerprints of 33 varieties of Populus and Salix

2.4 聚类分析

根据12个EST-SSR标记扩增的条带数据计算各品种间相似性系数，并按UPGMA法进行聚类(图2)。33个品种间的遗传相似系数为0.68～0.96，分别聚成杨属和柳属两大类群。

图2 33个杨树与柳树品种的聚类Fig.2 Dendrogram of 33 varieties of Populus and Salix

柳属的类群又分为两大分支：其中一支包含‘苏柳172’、‘苏柳795’、‘苏柳799’、‘竹柳’、‘苏柳932’、‘苏柳1010’和‘苏柳1011’共7个品种，均为乔木柳。其中亲缘关系相近的‘苏柳795’与‘苏柳799’来源于同一个旱白柳的杂交组合，‘苏柳1010’和‘苏柳1011’来源于同一个垂白柳的杂交组合。‘苏柳932’虽然也来源于垂白柳的杂交组合，但父母本与‘苏柳1010’、‘苏柳1011’的亲本均不相同。另外一支包含‘苏柳52-2’等14个灌木柳品种。‘苏柳52-2’与‘苏柳8-26’亲缘关系较近，虽然杂交组合不同，但母本为同一个簸箕柳。美国引进的8个商业品种中，宫部氏柳‘SX64’为雄株，与‘Otisco’聚在一起，推测可能为‘Otisco’的父本，或与其父本亲缘关系较近。而另一个宫部氏柳‘SX67’ 也与这两个品种单独聚类成一个小的分支。‘SV1’与‘S25’聚在一起，推测钻石柳‘S25’可能是‘SV1’的其中一个亲本。此外，两个欧洲红皮柳品种‘Fish Creek’与‘Onondaga’也单独聚类成一个小的分支。

杨属的类群也分为两大分支。其中单独的一支仅有‘银中’杨一种，其亲本为银白杨与中东杨，与其他黑杨派的品种亲缘关系较远；另外一支主要由11个黑杨派品种组成，其中亲缘关系相近的‘南林95’与‘南林895’来源于同一个杂交组合；‘苏杨7号’为‘I-69’杨的实生苗，与‘I-69’杨聚在一起；‘丹红’杨与‘巨霸’杨来源于同一个杂交组合，且母本与‘湘林90’相同，这3个品种聚成一个小的分支；欧美杨‘I-107’与‘I-108’亲缘关系相近，也聚成一个小的分支。

3 讨 论

SSR标记在基因组中各个区域广泛分布。EST-SSR标记来源于转录区域，与基因组SSR标记相比，通常认为其更加保守且多态性较低[23]，但其通用性较之基因组SSR要更高，开发的EST-SSR标记不但可应用于近缘种及属间[24-25]，甚至可应用于不同亚科与科之间[26-27]。Tuskan等[28]预测来源于毛果杨全基因组序列的SSR标记有30%～50%能用于柳树，但杨彦伶等[29]发现杨树基因组SSR在柳树中的通用性只有10.4%，而杨树EST-SSR标记在柳树中的通用性可达到54.2%。与此类似的，韩骞等[30]的研究表明：杨树中筛选的10对引物有6对在柳树中有扩增，柳树中筛选的10对引物有8对在杨树中有扩增。由此可见，已选取的38对柳树EST-SSR标记中有22对在杨树中扩增成功，通用性只有57.89%，较之韩骞等[30]的报道要低，但其所用的标记数量较少。尽管本研究所采用的EST-SSR标记来源于垂柳和簸箕柳，但也仅有26对(68.4%)标记在所有柳树品种中扩增成功，推测可能是由于柳树种类繁多，树种间分化较为复杂造成的，类似的情形在课题组前期的报道中也有所发现[20]。此外，本研究还发现SALeSSR0696标记中有1个等位片段仅在所有杨树品种中出现，而在所有柳树品种中缺失，后期可进一步验证能否作为属间特异性的标记。

杨树与柳树起源于共同的古四倍体祖先，古四倍体祖先基因组重新二倍化形成杨树和柳树两个分支[17]。自然界中杨树大多为二倍体，而柳树倍性较为复杂，从二倍体至十二倍体均存在，甚至同一个种内还存在不同倍性的情况[31]。一般而言，灌木类的柳树大多为二倍体，乔木类的柳树大多为多倍体[31]。虽然SSR标记为共显性标记，在二倍体个体中可以区分纯合子与杂合子，但在多倍体中较难区分各种基因型，且目前尚未有合适的统计软件用于计算各位点的参数值，如杂合度等。传统的高分辨率琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳基因分型技术分辨率有限，难以区分较小的等位片段差异，条带判读时主观性比较大，目前大多采用荧光标记结合高通量毛细管电泳的分型技术。荧光标记主要包括M13引物[32-33]、dUTP核酸标记荧光染料[7]，以及荧光标记引物[27,34]等，总体而言，荧光标记引物的分型效果要优于M13引物和 dUTP核酸标记荧光染料。

本研究中，33个杨树和柳树品种的亲缘关系基本与品种的遗传背景相吻合，也符合传统的杨柳科系统分类，得出的结论也与韩骞等[30]、贾会霞等[35]的研究一致。部分品种虽然来自同一个杂交组合，但由于性状分离而生长后期表型差异较大，从外观形态上也能区分出来，如‘苏柳1010’与‘苏柳1011’，‘苏柳795’与‘苏柳799’，‘南林95’与‘南林895’等。值得一提的是，本研究中加入‘竹柳’这一品种，主要是由于其较为耐盐，且干型、速生性较好，在沿海及北方一些地区应用较多。竹柳最初被报道由美国寒竹、朝鲜柳和筐柳杂交而成，并从美国引进。但从杂交可配性上看是不可能实现的，另外经江苏省林业科学研究院柳树研究团队调查，美国柳树研究相关机构从未选育出该乔木柳品种。而从本研究以及贾会霞等[35]的研究来看，‘竹柳’与‘苏柳172’、‘苏柳795’、‘苏柳799’亲缘关系较近，极有可能来源于相同或相近的亲本，但具体是哪一个无性系，还需进一步的鉴定与验证。由此可见，利用分子标记对品种进行鉴定与保护尤为重要。