CBX家族成员作为独立指标对肺癌患者生存预后的评估价值

白玉洁 喻 晶 陈海丹 李冬青

(1. 武汉大学基础医学院 病原生物学系 微生物教研室， 湖北 武汉 430071； 2. 湖北省肿瘤医院 检验科， 湖北 武汉 430065； 3. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 脊柱外科， 湖北 宜昌 443003)

肺癌是最凶险的肿瘤之一，5年生存率约为10%～20%[1,2]远低于其他类型的恶性肿瘤。据统计，2018年全球新增肺癌患者210万例，死亡180万人[3]。虽然目前已有成熟的肿瘤标志物，如癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、糖类抗原(carbohydrate antigen 125，CA125)、鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC)、神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)、胃泌素前体释放肽片段(pro-gastrin-releasing peptide，Pro-GRP)、细胞角蛋白 19 片段(CYFRA21-1)等用于肿瘤的筛查及治疗效果评价，但肺癌临床分型多，分子特征复杂，现有的肺癌肿瘤标志物对各型肺癌患者总生存率(overall survival，OS)的评价能力尚有不足。

Chromobox家族蛋白(CBX)是一类表观遗传调控复合物，它通过修饰染色质对目标基因进行转录抑制[4]。已知人类基因组中有8种CBX蛋白，都参与异染色质的调控、基因表达和发育程序。根据分子结构，CBX蛋白被分为两类：HP1组(包括CBX1、CBX3和CBX5)和Pc组(包括CBX2、CBX4、CBX6、CBX7和CBX8)。CBX成员的表达水平与肺癌患者OS显著相关，但不同家族成员之间并没有一致性。因此，本研究拟通过生物信息学的手段，对已有的研究数据进行深入地发掘和归纳，以助于明确CBX蛋白对肺癌预后评估的意义。

1 材料和方法

1.1 利用ONCOMINE数据库分析CBX的mRNA表达水平

ONCOMINE数据库(https://www.oncomine.org/resource/main.html)收录了 715个数据集和86 733个样本的芯片数据，用于DNA或RNA序列分析，功能十分强大[5]。本研究从该数据库中获得了8个CBX成员在不同肿瘤组织的转录表达数据(数据类型：mRNA)。用t检验比较肿瘤组织及其相邻正常对照组之间转录表达的差异。以P值为0.01，差异倍数为1.5，基因排名前10%为阈值。

1.2 利用UALCAN分析肺腺癌组织中8个CBX家族成员的mRNA表达及其与临床病理参数的关系

UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)是一个用于分析肿瘤组学数据的web资源。它提供基于基因表达的潜在基因图谱，以方便用户获取基因表达的信息[6]。本研究利用UALCAN分析了肺腺癌组织中8个CBX家族成员的mRNA表达及其与临床病理参数的关系。t检验比较转录表达差异，P<0.01为显著差异。

1.3 利用Human Protein Atlas分析人正常组织和肺腺癌组织中CBX的表达

Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/)包含了近20种常见肿瘤的免疫组化数据[7]。用户可以获取目标蛋白在特定肿瘤类型中的蛋白表达数据。本研究利用了该网站的免疫组化图像数据，比较了不同CBX家族成员在人正常组织和肺腺癌组织中的表达情况。

1.4 利用 Kaplan-Meier Plotter数据库分析不同CBX基因mRNA表达对肺腺癌预后的价值

Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)能够评估54 000 个基因(mRNA、miRNA、蛋白质)对21种肿瘤生存率的影响，包括乳腺癌(6 234例)、卵巢癌(2 190例)、肺癌(3 452例)和胃癌(1 440例)。数据来源包括GEO和TCGA数据库。该工具基于荟萃分析，可发现和验证生存生物标志物(survival biomarkers)[8]。本研究应用Kaplan-Meier Plotter分析不同CBX基因mRNA表达对肺腺癌预后的价值。在Kaplan-Meier绘图仪(K-M绘图仪)上，根据mRNA水平的中位数将肿瘤患者分为CBX高表达组和CBX低表达组，并用K-M生存曲线进行验证。在K-M绘图仪网页上可以找到有关危险病例数、mRNA表达水平中位数、风险比(hazard ratio，HR)、95%置信区间(confidence interval，95%CI)和P值等信息，当P<0.05时，则视为具有显著性差异。

2 结果

2.1 多种肿瘤的肿瘤组织和正常组织的CBX mRNA表达有显著差异

ONCOMINE数据库资料显示，在20种肿瘤中，CBX家族成员mRNA在肿瘤组织中的表达与正常组织有差异。其中，肺癌尤其是肺腺癌这一类型组织的CBX1、CBX3、CBX4和CBX5的mRNA表达显著高于正常组织(见图1和表1)，而肺癌组织CBX7的mRNA表达显著低于正常组织 (见图1)。

2.2 CBX家族各个成员在原发性肺腺癌组织中mRNA表达水平不同

UALCAN数据库资料也同样显示，与正常肺组织相比，原发性肺腺癌组织的CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8的mRNA表达均显著上调(图2A～2E，2H)，而CBX6和CBX7 mRNA表达均显著下调(图2F，2G)。

2.3 CBX家族的不同成员在原发性肺癌组织中蛋白表达水平的差异

Human Protein Atlas数据库资料显示，CBX2、CBX4、CBX5、CBX6和CBX8蛋白在正常肺组织中不表达或低表达，而在肺癌组织中观察到低和中等表达(图3B，3D～3F，3H)。此外，CBX1和CBX3蛋白在正常肺组织中呈低表达或中等表达，而在肺癌组织中呈中等表达或高表达(图3A，3C)。然而，无论是在正常肺组织或肺癌组织中，CBX7蛋白的表达都很低(图3G)。

2.4 CBX mRNA表达水平与肺腺癌患者的AJCC-TNM临床分期显著相关

采用UALCAN分析显示，CBX家族成员的mRNA表达与患者个体肿瘤分期显著相关。随着肿瘤病理分期的增加(1期～4期)，CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8的mRNA的表达也趋于更高(图4A～4E、4H)。CBX6，CBX7的mRNA表达水平随着肿瘤分期的增加而趋于降低(图4F、4G)，其中，CBX7 mRNA降低幅度更为显著。

注：数据来源：UALCAN； Normal：正常组织； Primary tumor：肺腺癌组织； n：病例数图2 不同CBXs家族成员在肺腺癌组织及癌旁正常肺组织中的mRNA表达

注：数据来源Human Protein Atlas；Normal：正常组织；Cancer：肺癌组织；蓝色虚线区域：CBXs蛋白表达阳性图3 CBXs家族各成员在肺癌组织和正常肺组织中的典型免疫组化图像

注：数据来源：UALCAN；Normal：正常组织；n：病例数；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001图4 CBXs家族各成员的mRNA在肺腺癌不同临床分期中的表达水平

2.5 CBX家族成员的mRNA表达与肺癌患者OS显著相关

CBX2、CBX4和CBX8 mRNA表达高的患者OS较短，(图5B，CBX2：HR =1.55，95%CI：1.31～1.83，P<0.01；图5D，CBX4：HR=1.22，95%CI：1.08～1.39，P<0.01；图5H，CBX8：HR=1.18，95% CI：1.04～1.34，P<0.05)。CBX7 mRNA高表达的肺癌患者OS良好，呈显著相关(图5G，HR=0.57，95%CI：0.5～0.65，P<0.01)。然而，CBX1，CBX3，CBX5和CBX6的 mRNA表达与肺癌患者的预后无关(图5A，CBX1：HR=0.89，95%CI：0.78～1.01，P=0.063; 图5C，CBX3：HR=1，95%CI：0.88～1.14，P=0.99；图5E, CBX5：HR=0.89，95%CI：0.79～1.02，P=0.085；图5F，CBX6：HR=0.98，95%CI：0.86～1.11，P=0.75)。

注：数据来源：Kaplan-Meier Plotter；Logrank检验对肺癌患者进行生存分析，比较CBXs高表达组和低表达组患者OS；横坐标：生存时间；纵坐标：生存率；红线：CBXs高表达组；黑线：CBXs低表达组；low和high后面的数字代表横坐标各时间段相对应的患者例数。ID：各基因对应的探针号； HR：风险比，HR>1，危险因素；HR<1，保护因素图5 CBXs家族成员mRNA表达对肺癌患者预后的影响

3 讨论

目前，影像学检查、肿瘤标志物检查是无创筛查肺癌，评价及监测治疗效果的主要方法。然而，普通CT对早期肺癌或者复发转移灶敏感性较低。血清肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和NSE均对肺癌的诊断有一定的提示作用，亦可作为术后、化疗后检测肿瘤是否复发的指标，但会因为良性肿瘤、妊娠、慢性炎症性疾病或其他因素而出现假阳性，其结果往往不太可靠[9]。因此，寻找更合适的、非侵袭性生物标志物来预测肺癌发生或评估预后，对肺癌的临床治疗具有重要的指导意义。多项研究证实，CBX在肺癌的发生发展中起关键作用[10-12]，但CBX家族中不同的成员在肺癌发病机制中的作用却不太相同，庞杂繁冗的数据模糊了CBX作为肺癌生物标志物的意义。因此，本研究对有关CBX和肺癌的海量数据进行生物信息学分析，阐明了不同基因型CBX在肺腺癌中的表达情况及预后价值。

通过数据分析发现，在肺癌患者中，CBX1、CBX2、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8均存在mRNA过度表达，但其中仅有CBX1、CBX3、CBX4、CBX5和CBX8蛋白过度表达，而CBX2蛋白并没有过表达，这可能是其转录后修饰受到限制。其次，部分CBX mRNA表达与肺癌患者的个体肿瘤分期显著正相关，表达越高，肿瘤分期越晚。此外，高表达的CBX2、CBX4和CBX8与肺癌患者的短OS显著相关，提示预后差；而高表达的CBX7与肺癌患者的良好OS显著相关，提示预后相对良好。

除了肺癌，CBX成员在其他肿瘤中也显示出其与患者的OS、肿瘤分期的显著相关性，与本研究中有关CBX与肺腺癌关系的趋势基本一致。部分研究还探讨了相关的机制，例如，在前列腺癌的治疗中，根据患者的Gleason分级(一种广泛使用的组织分级方法)决定选取何种治疗方案，而前列腺癌组织的CBX1表达水平增高与患者Gleason评分密切相关[13]。其机制可能为，前列腺癌组织的CBX1表达水平受到抑制后，癌细胞生长周期被阻滞在G1期，从而抑制癌细胞的生长[13]。在乳腺癌中，CBX1的过度表达也提示乳腺癌分化不良和患者预后差[14]。此外，乳腺癌和白血病细胞中也存在CBX2的过度表达现象，并且CBX2水平也与肿瘤转移进展和患者短OS显著相关[15]，CBX2基因还能增强白血病细胞的致瘤性和自我更新能力[16]。CBX3在人结直肠癌中过度表达，它通过直接调控CDKN1A分子，促使组蛋白H3K9启动子甲基化，促进结肠癌细胞增殖[17]。在肝细胞癌中，CBX4在肝癌组织中高表达，并且和多种临床参数有关，包括甲胎蛋白水平、肿瘤大小、病理分化、患者OS和无复发生存率(recurrence-free survival，RFS)[18, 19]。在本研究中也我们发现，CBX4在肺腺癌中具有类似的效应。同时，CBX8作为一个癌基因可以上调EGR1和miR-365-3p，从而激活AKT/β-catenin通路，促进肿瘤的生长和转移，而沉默CBX8基因表达则抑制了上述效应[20]。在本研究中，我们发现CBX8和上述CBX成员一样，其mRNA和蛋白表达显著增高，并且CBX8的mRNA表达与患者的肿瘤分期显著相关。

研究发现，CBX6在肝癌临床样本和肝癌细胞系中上调，并且CBX6的表达与较大的肿瘤(直径≥5 cm，P=0.011)和多发性肿瘤(n≥2，P=0.018)显著相关；生存分析表明，与低表达CBX6的患者相比，CBX6表达水平高的患者RFS和OS显著缩短，多变量分析证实CBX6表达增加是肝癌患者的独立不利预后因素；功能研究表明，CBX6在体外和体内均能显著促进肝癌细胞的生长；其机制研究表明S100A9/NF-κB/MAPK通路是介导CBX6功能的重要途径[21]。CBX6的过度表达促进了肿瘤的进展，并预示着肝细胞癌预后不良。另外有研究在TCGA数据库中发现，CBX6在多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)中表达下调，并且其表达量与肿瘤分期呈负相关[22]。在GBM细胞系中过表达CBX6，发现细胞增殖受到抑制[22]。上述研究提示，CBX6在多种肿瘤的发生发展中呈现出不同的功能。

有趣的是，CBX7低表达预示肺癌患者有更好的生存率。CBX7是肿瘤相关研究中最具特征的CBX蛋白[23]。研究显示CBX7可通过抑制PTEN/AKT信号转导拮抗胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[24]。另有文献报道，采用qRT-PCR、IHC以及Log-rank分析等方法对浸润性乳腺癌进行多变量分析，结果表明只有EZH2过表达和CBX7低表达与乳腺癌短无转移生存率(metastase-free survival，MFS)显著相关， EZH2过表达和CBX7低表达同时存在可作为一个独立的预后因素[25]。CBX7亦可通过DKK-1介导的Wnt信号通路抑制乳腺肿瘤的发生。这些研究都提示，在部分肿瘤中(包括本研究关注的肺腺癌)，CBX7可能是一种重要的肿瘤抑制因子[26]。但是，该观点在甲状腺癌和胰腺癌中却不成立，因为CBX7表达缺失的甲状腺癌和胰腺癌组织具有高度恶性表型[27]。此外，还发现上调CBX7表达可提高人类肺癌细胞对伊立替康治疗的敏感性，提示其可能是提高化疗疗效的一个潜在措施[28]。总之，关于CBX7的生物功能，在不同肿瘤中具有明显差异，提示CBX7可能同时存在抑癌或致癌功能，这取决于肿瘤类型、肿瘤微环境和各种蛋白之间的相互作用。

综上，检测患者肺组织CBX mRNA水平可以作为肺腺癌患者生存期预测的生物学指标，尤其以CBX2、CBX4和CBX8更有意义，它们的高表达与肺癌患者的短OS显著相关，提示预后差；而CBX7表达水平高与肺癌患者的良好OS显著相关，提示预后相对良好。同时，CBX7高表达还提示患者采用伊立替康治疗时会有更好的疗效。CBX1、CBX3、CBX5和CBX6的mRNA表达与肺癌患者的预后无关。因此，在CBX蛋白家族中，联合检测CBX2、CBX4、CBX7和CBX8 表达水平，对肺癌患者生存预后有更好的评估价值，亦可作为个体化治疗的潜在靶点。本研究分析的结果将有助于更好地理解肺癌分子生物学的复杂性和异质性，并为后续深入研究提供方向。