清金化痰汤联合头孢哌酮/舒巴坦对产ESBLs肺炎克雷伯菌体外抑菌的研究

周晓莹 郭永聪 刘艳 邓文喻 毕婷婷

1广东省妇幼保健院检验科，广州 510010；2广东省妇幼保健院药学部，广州 510010

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是从人体、自然环境中感染检出率较高的革兰阴性杆菌，常常导致人体泌尿道、呼吸道或其他部位出现炎性症状，也能引发败血症、脑膜炎等疾病。随着β-内酰胺类抗生素在临床上的广泛使用，KP耐药率呈现上升的趋势［1］。这主要与KP能产生超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）有关。ESBL 是由质粒介导的，主要以单酰胺类、青霉素酶类及头孢菌素抗生素为水解对象的β-内酰胺酶。近年来发现，产ESBL 菌株耐药的抗生素从对常规β-内酰胺类耐药发展到有部分对氨基糖苷类、喹诺酮类等也出现耐药的现象，临床上尚未研究出有效的治疗方案。我国细菌耐药性监测中显示，2018年产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌（ESBL-KP）的检出率达30%以上，对绝大部分青霉素类、一到三代头孢菌素的耐药率也高于30%［2］。ESBL-KP 用药方案越来越受到临床医生的广泛关注，因此，如何减少抗生素的耐药率，并增强对ESBL-KP 的疗效有着十分重要的临床意义。本文通过对15例ESBL-KP 菌株进行体外实验，以探讨清金化痰汤联合头孢哌酮/舒巴坦在治疗ESBL-KP 中的应用前景。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 本文样本选取2019 年1 月至2020 年2 月期间，本院患者送至检验科进行检验的痰标本，分离出产ESBL-KP 菌株15 例。分为抗菌药组（头孢哌酮/舒巴坦）、中药组（清金化痰汤）、联合组（清金化痰汤联合头孢哌酮/舒巴坦）以及阴性对照组（培养液）4 个组别。所选菌株严格按照《全国临床检验操作规程》进行分离培养操作。采用Vitek 2 Compact 细菌分析仪鉴定及初步选出ESBL 阳性菌株，根据CLSI 推荐的纸片扩散法对初筛后的15 株ESBL-KP进行表型确认试验。

1.2 仪器与试剂 主要仪器：梅里埃VITEK2 Compact细菌分析仪，海尔HR型生物安全柜，HF240型培养箱，新华牌LMQ.C 型立式高压灭菌器；主要试剂：头孢哌酮/舒巴坦（SCF，购买自辉瑞制药公司，2∶1），M-H 琼脂平板、M-H 肉汤培养基、哥伦比亚血平板（均为杭州天和公司生产）。

1.3 方法

1.3.1 清金化痰汤制备 将黄芩、山栀子各12 g，茯苓、橘红、贝母、麦门冬、桔梗各9 g，桑白皮、瓜蒌仁、知母各15 g，甘草3 g作为原料倒入药锅内，加水400 ml浸泡30 min后用武火煮沸，沸后改用文火煎煮30～40 min，收集煎液，用无菌纱布过滤，继续加水300 ml，同法煎制，将2次煎液过滤合并，加热浓缩至约33 ml，得每1 ml 相当于原药材4 g 的中药水煎剂溶液。

1.3.2 细菌培养和菌液制备 将15 株产ESBL 肺炎克雷伯菌株，采用分区划线法分别接种，经35℃18～24 h培养后，用一次性接种环挑取单个菌落1～2 个，调整至0.5 麦氏浊度，加入M-H 肉汤作直至稀释倍数为1∶10，以此调制为15份实验菌液。

1.3.3 测定单药最低抑制浓度 将配制备好的15 株头孢哌酮/舒巴坦、清金化痰汤药物原液，用肉汤倍比稀释将两种药物分别配制成8 个浓度梯度的药液备用，准确吸取1 ml 各浓度药液依次加入试管，每管加入配制的15 株产ESBL 肺炎克雷伯菌菌液50 μl；同时设阴性对照；35℃培养18～24 h 后肉眼大致观察肉汤的清亮和混浊程度，中药浓缩液颜色太深观察不清的，从中取一环接种于普通培养基上，置37℃恒温箱内培养24 h 后观察结果，记录15 株菌对头孢哌酮/舒巴坦、清金化痰汤的MIC。

1.3.4 联合药敏试验 根据15 株产ESBL 肺炎克雷伯菌对清金化痰汤、头孢哌酮/舒巴坦的MIC 结果，以单药对15 株ESBL-KP 所测MIC 的2 倍作为最高浓度，采用以上同样稀释方法分别配制出8 个浓度梯度，不同浓度清金化痰汤、头孢哌酮/舒巴坦药液依次取量0.5 ml，应用棋盘法的设计两两配对组合加入试管中，然后将上述盛有药物稀释液的试管在121℃下高压灭菌30 min，冷却后再分别加入15株试验菌液50 μl，35℃培养18～24 h。选择上述棋盘模型中，记录两药联用最佳组合效应时的MIC 值，即清金化痰汤联合的MIC 和头孢哌酮/舒巴坦联合的MIC；单独用药时的MIC，即清金化痰汤单用的MIC 和头孢哌酮/舒巴坦单用时的MIC，最后计算部分FIC，判定清金化痰汤与头孢哌酮/舒巴坦联用后的抑菌效果。

1.3.5 结果判别 35℃培养18～24 h 后，肉眼大致观察管底无出现细菌沉淀、肉汤清亮的最低抗菌药物浓度记录为MIC。FIC指数=（头孢哌酮/舒巴坦药联用时的MIC÷头孢哌酮/舒巴坦药单用时的MIC）+（清金化痰汤联用时的MIC÷清金化痰汤单用时的MIC），FIC≤0.5 为协同作用；0.5＜FIC≤1 为相加作用；1＜FIC≤2 为无关作用；FIC＞2 为拮抗作用。

1.4 统计学分析 本文数据处理参考SPSS20.0 分析软件，计量资料表示为均数±标准差（），单药与联合用药组间的计量数据采用t 检验比较，当P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 单药及联合用药对ESBL-KP 菌株MIC 的影响中药组、抗菌药组分别与联合组相比，MIC 差异均有统计学意义（均P＜0.05）。各组MIC值均数见表1所示。

2.2 联合用药的FIC 指数 清金化痰汤联合SCF 用药对ESBL-KP菌株的FIC≤0.5，为协同作用。

表1 各药物分组对ESBL-KP的MIC值

3 讨 论

本院在2016 至2018 年期间临床总共分离出1 632 例KP，其中ESBL-KP 有817 例，检出率高达50.0%。碳青霉烯类抗生素是治疗ESBL-KP 的最后一道防线，但KP 对美罗培南和亚胺培南的耐药率分别从2005 年的2.9%和3.0%上升到了2017 年的24.0%和20.9%，耐药率上升幅度高达8倍，而且一旦出现碳青霉烯酶耐药的KP，多数患者病情危重，病死率高。我们另辟蹊径，寻找治疗ESBL-KP新思路。

本文中清金化痰汤与头孢哌酮/舒巴坦联合应用对产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌在体外环境下具有明显的协同抑制作用。近年来，SCF 广泛应用于细菌性肺炎的治疗并具有良好的临床疗效，对产ESBLs 菌株有较强的抑制作用，但其耐药率也明显提高，可达32.1%。中药治疗病原菌因其具有不易产生耐药、不良反应小等优势而受到广泛的关注。近年研究表明中医药对逆转耐药细菌具有很好的优势及广阔的探索空间，其机制大致可分为直接抑制和间接抑制作用［3-5］。直接抑制包括抗生素靶标位点的突变或重组、抑制细菌外排泵、消除生物被膜、逆转细菌耐药质粒以及改变细胞膜的通透性等；间接抑制主要指通过增强机体免疫力及改善微生态的稳定而产生抗耐药性。

KP 引起的肺部感染中医证型以实证为主，痰热壅肺证是其主要证候［6］。针对痰热壅肺的病理症状，服以清热润肺、化痰止咳的清金化痰汤临床疗效已确切获多个研究的认可［7-8］。清金化痰汤方中黄芩为君药，黄芩苷为其主要成分，知母、桑白皮、瓜蒌仁、山栀子共为臣药。黄芩有明显地抑制炎症反应，调节免疫功能的作用［9］；黄芩和鱼腥草水煎药则含有可溶性抑菌成分，能消除KP的生物被膜［10］。张晓玲和于翠香［11］研究显示黄芩苷与某些抗生素联用后，可以通过抑制β-内酰胺酶、质粒消除逆转多重耐菌的耐药性，对抗菌活性有一定协同作用。Luo J 等［12］则证明了黄芩苷能抑制铜绿假单胞菌生物膜形成并具有增强多种常见抗生素抑菌作用的能力。知母主要通过抗菌、抗炎、解热发挥重要作用［13］，其中前胡、知母、黄芩等联合西药在婴幼儿KP肺炎中疗效显著。其他成分如桑白皮和鱼腥草可抑制肥大细胞分化、增殖及释放炎性介质［14-15］；瓜蒌子可减轻炎症反应，起到有清热涤痰的作用［16］；茯苓可增强机体巨噬细胞免疫功能［17］等。由此推测，清金化痰汤可通过黄芩直接消除生物被膜、抑制β-内酰胺酶活性或逆转细菌耐药质粒以及通过知母、桑白皮、瓜蒌子等抗菌与抗炎的间接抑制作用对ESBL-KP达到抑菌效果。

本研究从中药角度寻找改善头孢哌酮/舒巴坦在KP 应用的治疗方案，取得一定预期结果，希冀可以改善ESBL-KP肺炎治疗效果和患者预后，提高肺炎治疗水平，为临床的治疗和研究提供一些新的思路。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。