人脐带间充质干细胞在帕金森病的应用进展

邵丽诗，马逸群，梁磊，罗成诚，王家平

（1.昆明医科大学第二附属医院放射科，云南 昆明650101；2.昆明医科大学第一附属医院肿瘤外科，云南 昆明650000；3.临沧市云县人民医院急诊科，云南 临沧675800）

帕金森病（Parkinson's disease PD）是中枢神经系统（CNS）中第二常见的进行性神经退行性疾病，其病理特征是黑质多巴胺能（DA）神经元进行性损失及出现路易体[1]。PD的典型表现是静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射障碍异常的运动障碍和广泛的非运动症状，其中认知能力下降是最常见的非运动症状[2]。随着我国人口老龄化的日益进展，帕金森病的患病率和发病率呈明显的增长趋势[3]。目前，PD的治疗手段主要为口服左旋多巴的药物治疗[4-5]和深部脑刺激（DBS）[6]及手术等，以达到维持脑内多巴胺和乙酞胆碱的相对平衡。但随着时间的推移，PD患者的病情呈进行性恶化[7-8]，严重影响患者的生活质量，也给患者家庭及社会带来沉重经济和心理负担[9]。由于DA神经元细胞一旦变性坏死则不可再生，细胞替代治疗已被认为是治疗帕金森病的新方法[10]。人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）因具有显著的神经分化特征、免疫调节特征和向脑损伤源迁移等较多优点己被认为是治疗PD的种子细胞之一[11]。本文对hUC-MSCs及其在帕金森病治疗进展进行综述。

1 hUC-MSCs的生物学特性及应用

1.1 人脐带间充质干细胞hUC-MSCs的概况MSCs是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞，其存在于全身结缔组织和器官间质中。hUC-MSCs来源于包裹脐血管周围的胶样组织中，即华尔通胶或沃顿胶。早在2003年，Covas等[12-13]分别从人脐静脉内皮和内皮下层成功分离得到hUC-MSCs。体外培养的hUC-MSCs呈贴壁生长，镜下呈形态相对均一的梭形细胞，也可见到多角形细胞。细胞周期分析显示体外扩增传至30代的hUC-MSCs 80%处于G0～G1期，为正常二倍体，无形态学和增殖特性的改变[14]。与其他来源的MSCs一样，hUC-MSCs高表达CD73、CD90、CD105，并表达粘附分子标记如CD13、CD29、CD44，CD54，低表达HLA-ABC等MHC-Ⅰ分子标记，不表达CD34、CD45和CD31等造血干细胞标志及HLA-DR、HLA-DA、HLA-DP、HLA-DQ等MHC-Ⅱ分子标记[15-16]。Hochedlinger等[17]发现hUC-MSCs表达胚胎干细胞特异性基因OCT-4，与维持干细胞未分化状态密切相关，表明脐带hUC-MSCs具有干细胞特性。hUC-MSCs具有多分化潜能，可向外胚层、内胚层和中胚层细胞分化。体内研究发现hUCMSCs可分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞等，体外诱导还可分化为成软骨细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、内皮细胞、生殖细胞等[18-21]。

1.2 hUC-MSCs的应用hUC-MSCs可能具有更强的可塑性和极低的免疫原性，已被许多学者认为是应用于细胞治疗、组织工程和基因治疗理想的靶细胞。近年来，hUC-MSCs开始用于治疗心脑、神经、免疫等疾病方面，并证实hUC-MSCs可促进心肌细胞的再生，调节血糖，修复创面和恢复神经功能等，为现代医疗技术发展开拓新的领域。

hUC-MSCs与BMSCs、ADMSCs相比，具有以下优势：①不受伦理道德问题束缚；②hUC-MSCs从废弃脐带组织中获取，来源广泛，取材方便，分离提纯工艺较简化，且无创操作，避免了骨髓穿刺痛苦；③从人脐带获取的间充质细胞含量较高、增殖能力强；④免疫原性低，在异体移植间无免疫排斥反应或反应较弱；⑤易于转染外源基因，可作为基因治疗的载体，用于细胞治疗和基因治疗。近年来，随着干细胞工程的不断发展，来源于人脐带的间充质干细胞已经被证实在组织工程领域较好的应用前景。

2 hUC-MSCs与帕金森病

2.1 hUC-MSCs移植治疗PD PD发病机制尚不明确，但研究认为炎症、线粒体功能障碍、氧化应激和促凋亡机制可能参与其病理过程。PD的主要病理改变是选择性的中脑黑质DA神经元丧失，传统的治疗方法均无法逆转神经变性和增加DA神经细胞数目，因此，开发新型方法治疗PD具有重要意义[22]。神经细胞再生和修复缺损坏死的组织，是治疗PD的理想方法[10]，因此，为更充分有效地利用细胞疗法，需考虑神经细胞的来源及其在物理和生物学上模拟宿主实质组织的微环境[23]。hUC-MSCs由于可塑性强、免疫原性低、体外扩增能力强、转染外源基因容易等优势，已成为的理想靶细胞。截至目前，hUC-MSCs在治疗PD研究中，动物实验主要参考Shetty等[24]的方法制备PD模型，临床试验主要采用在上平甲状软骨上缘，下至甲状软骨卜缘1 cm处行颈动脉穿刺或第3、4腰椎间隙行蛛网膜下腔注射hUC-MSCs。2000年，Woodbury等[25]首次报道BMSC在体外通过诱导分化为神经元细胞。Kopen等[26]通过将标记的大鼠BMSC注射入新生小鼠的侧脑室发现其能在体转化为神经细胞。Fu等[18]将人脐带MSCs来源的酪氨酸轻化酶阳性细胞移植至PD大鼠模型的纹状体内可存活4个月以上，并向移植部位的头、尾两侧迁移约1.4 mm,苯丙胺诱发的大鼠转圈行为显著改善。这为寻找治疗帕金森病的理想细胞指明了新的方向。Zhao等[27]在体外将hUC-MSCs诱导成多巴胺能神经元（DAergic）与hUCMSCs比较对PD大鼠治疗作用，结果发现，hUC-MSCs诱导生成的DAergic对PD大鼠行为学症状明显减轻，优于直接应用hUC-MSCs移植。hUC-MSCs在我国已开展至临床试验阶段，邱云等[28]经颈动脉注射hUC-MSCs治疗8例PD患者，结果表明，患者的日常生活动和运动症状得到明显改善。季兴等[29]对38例PD患者行蛛网膜下腔注射hUC-MSCs，1个月后所有患者的UPDRS评分均显著改善，随访期间未出现不良免疫反应。但目前国外通过hUC-MSCs移植治疗PD的报道较少。

2.2 hUC-MSCs作为转基因载体治疗虽然hUC-MSCs移植治疗在中枢神经系统疾病中领域取得了一些突破性进展，但是移植后的hUC-MSCs存在生存率低、远期疗效不明显等问题。有研究利用hUC-MSCs作为基因治疗的载体以此提高疗效。黄仕雄等[30]将认为能促进干细胞向多巴胺能神经元分化有关的细胞核受体超家族的转录因子基因Nurrl进行体外修饰hUC-MSCs，发现其较单纯hUC-MSCs向DA神经元分化率明显增加，2009年，又发现移植Nurrl基因修饰hUC-MSCs来源的DAergic治疗PD模型鼠，更能有效地促进大鼠脑内DA和纹状体区酪氨酸轻化酶（tyrosinehydroxylase，TH）含量的表达[29]。樊志刚等[31]对PD大鼠有侧脑室注射质粒pEGFP-C2-TH基因修饰的hUC-MSCs后，观察到移植的细胞活动范围更大，存活时间更长相对于单纯的hUC-MSCs。免疫组化显示植入酪氨酸羟化酶基因修饰的的细胞TH表达阳性，移植后PD大鼠的纹状体内多巴胺含量也明显增加，说明hUC-MSCs联合基因治疗PD的疗效优于单独移植hUC-MSCs，为治疗PD提供一种新的策略。除采用基因修饰的方法增加多巴胺的表达量治疗PD外，还有一些研究发现移植前用多效生长因子（pleiotro phin，PTN）预处理供体细胞，能更有效改善大鼠的旋转行为，促进更多的TH阳性细胞存活[32]。

3 hUC-MSCs移植治疗的机制

hUC-MSCs移植对治疗PD有一定疗效，但是其具体作用机制尚未完全阐明，可能通过以下几种机制促进神经功能恢复。

3.1 神经营养移植后hUC-MSCs能到达局部损伤部位，通过分泌多种生长因子、细胞因子、细胞外基质（ECM）蛋白和有效的神经调节为神经系统创造有利环境的分子再生。hUCMSCs可向周围释放多种保护性因子，如神经营养素3（NT3）、神经递质因子（BDNF）、血管表皮生长因子（VEGF）、IL-6和干细胞因子（SCF）[33-34]等，这些细胞因子通过促进血管再生和发挥抗炎、抗凋亡等从而挽救变性边缘的DA神经元，提高周围神经细胞的存活率。另外，hUC-MSCs可产生细胞外基质（ECM）蛋白质，支持神经细胞附着、生长、神经发生和功能修复[31]。因此，hUC-MSCs分泌的多种因子参与DA的保护和修复，这可能部分解释了hUC-MSCs对PD的治疗作用。

3.2 细胞替代移植的hUC-MSCs直接分化DAergic，或激活内源性神经干细胞间接分化为相应类型的神经细胞，替代缺失的DAergic。但目前越来越多的研究表明，细胞替代作用并不是hUC-MSCs作用的主要机制[35-36]。移植的hUC-MSCs在脑内表达神经元及星形胶质细胞的特异性标志物通常低于5%，且其数量在移植后会逐渐下降。因此，hUC-MSCs是否通过细胞分化替代改善神经功能也有待进一步研究。

3.3 免疫调节有研究表明，在PD患者尸检中观察到激活的小胶质细胞广泛增殖[37]。炎症刺激可诱导小胶质细胞的增殖效应，hUC-MSCs可抑制这种增殖效应并降低小胶质细胞对促炎因子的表达[38]。同时,在PD患者的大脑中检测到促炎细胞因子水平的升高，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL-1）和干扰素γ（IFN-Y）[39-40]。此外，研究报道PD动物模型的免疫抑制环孢菌素A的表达减弱[41]。说明hUCMSCs的免疫调节和抗炎作用在PD治疗的重要性。

4 小结

近年来，干细胞作为一种有希望的修复性治疗方法已经成为PD研究领域的前沿，hUC-MSCs作为一种新型种子细胞，具有取材无创、无伦理争议、低免疫原性等优点，尤其将分娩时遗弃的脐带作为主要来源。同时，通过基因转染手段，促进hUC-MSCs定向分化为多巴胺能神经元，为临床治疗PD提供新的思路。但hUC-MSCs治疗如何获得最有效的神经保护作用的移植方案，以及移植时间窗、细胞数目、途径、安全性等问题，还需要进一步的研究。随着人们对hUC-MSCs的生物学特性及临床实践不断深入，我国规范的hUC-MSCs库建立，未来hUC-MSCs将有望成为治疗PD的恢复性方法。