草莓种苗的脱毒技术试验研究

李晓亮 杨世先 杨光炤 王文智 张建康 钱遵姚 董 广 张军云

（玉溪市农业科学院 云南玉溪653100）

草莓（Fragaria ananassaDuch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物，是一种重要的经济作物[1]，在我国很多地方被广泛栽培，具有较好的经济效益。

草莓是一种以匍匐茎无性繁殖的作物，因长期种植，体内病毒逐年积累加重，病毒病发生严重[2]。一旦草莓感染了病毒后，植株生长缓慢、叶皱缩、果实逐年变小、畸形、品质差，一般减产30%～80%[3]，草莓病毒病已成为了草莓生产中的一大危害。

草莓病毒病，目前还没有一种比较好的药剂可用于防治。培育无病毒母本苗，栽培无病毒苗木，是防治草莓病毒病的根本对策[4]。目前世界上生产草莓无毒苗最普通、最有效的方法是用茎尖培养法培育草莓无病毒苗[5]。

草莓脱毒技术的研究，国内已有很多报道，上海交通大学农业与生物学院何欢乐等的研究结果[2]表明，最适宜的草莓脱毒法为改良热处理+茎尖培养法，即先将草莓匍匐茎放在40℃热水中处理4 h，再剥取≤0.5 mm大小的茎尖进行培养，脱毒效果良好；高山林[3]的研究结果表明，把切取的草莓芽洗净后经过高温短时间热处理，然后用茎尖培养法获得无病毒草莓苗；刘健等[6]的研究表明，经40～42℃高温处理草莓匍匐茎后再剥取茎尖，得到的试管苗能达到100%脱毒率；顾地周等[7]的研究表明，利用试管内高温处理（在温度35～50℃条件下，培养30～80 d）结合茎尖脱毒的方法可以完全脱除草莓病毒，从而建立了草莓脱毒体系；覃兰英等[8]的研究表明，将草莓在35℃下热处理7 d后，逐步升温至38℃，在湿度40%～68%、光照度4 000～5 000 lx条件下热处理35 d后，将长出的新茎茎尖再行组培，可获得100%的脱毒苗；童尧明等[9]的研究表明，以草莓茎尖分生组织0.2～0.4 mm一次性培养出组培苗，出苗率83%～90%，脱毒率达100%；高遐虹、李梅[10]的研究结果表明，采用草莓的茎尖2次脱毒法，对宝交早生等6个草莓品种的茎尖进行组培脱毒，经检测可全部脱除草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒和草莓皱缩病毒，茎尖2次脱毒法操作简便、易掌握，脱毒率达100%，分化率达79%。

结合国内已有的草莓脱毒技术报道，本研究开展了草莓种苗的脱毒技术试验，旨在提出一种操作简便、脱毒率高的草莓种苗脱毒技术。

1 材料与方法

1.1 试验地点

玉溪市农业科学院组培室。

1.2 试验材料

草莓茎尖采集于玉溪市农业科学院研和贾井基地，3个参试的草莓品种为鬼怒甘、章姬、红颜。

1.3 试验时间

2019年7～12月。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 设置5种草莓种苗的脱毒技术试验处理，处理1：对草莓茎尖由外向内逐层剥去茎尖的幼叶，切取肉眼可见的茎尖生长点（1.0～1.5 mm）接种于诱导培养基上，然后增殖、生根获得草莓组培苗；处理2：采用“直接茎尖培养”的脱毒技术，在解剖镜（8～40倍）下由外向内逐层剥去茎尖的幼叶，切取0.2～0.5 mm的茎尖生长点接种于诱导培养基上，然后增殖、生根获得草莓组培苗；处理3：采用“改良茎尖培养”的脱毒技术，将通过“直接茎尖培养”法获得的新生匍匐茎的茎尖再进行第2次茎尖剥离，切取0.2～0.5 mm的茎尖生长点接种于诱导培养基上，然后增殖、生根获得草莓组培苗；处理4：采用“直接茎尖培养+高温处理”的脱毒技术，将通过“直接茎尖培养”法获得的草莓组培苗放置于光照培养箱中，保持白天35～40℃光照培养12 h/d，夜间25℃暗培养12 h/d的条件下培养30 d，之后将存活的芽增殖、生根获得草莓组培苗；处理5：采用“直接茎尖培养+冷处理”的脱毒技术，将通过“直接茎尖培养”法获得的草莓茎尖放置于5℃的冰箱（组培苗需整瓶密封好）中培养60 d，然后增殖、生根获得草莓组培苗。

1.4.2 草莓苗的组培 按照李晓亮等[1]的技术实施。

1.4.3 草莓苗的病原检测 各处理的草莓组培苗送样到云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所进行病原检测，检测方法：将抽提样品负染色制片，FEI透射电子电子显微镜检测。

1.4.4 数据调查与分析 调查各种处理后的草莓组培苗存活情况、苗的质量，根据病原检测结果分析各处理对草莓病原脱毒效果的影响。

2 结果与分析

2.1 草莓种苗的存活率

从表1可知，经过处理1、处理2、处理3、处理5的试验处理后，草莓种苗的存活不受影响，存活率为100%，但经过处理4试验处理后，绝大部分种苗死亡，存活率仅为20.12%～25.43%，说明大部分草莓种苗不耐高温。

2.2 草莓种苗的病原检测结果

从表2可知，鬼怒甘、章姬、红颜3个草莓品种的组培苗经病原检测后，处理1中均观察到病毒粒子，而处理2、处理3、处理4、处理5中的组培苗中均未检测到病毒粒子。说明不同处理获得的草莓组培苗其病原含量不同，处理2、处理3、处理4、处理5的脱毒效果较好。

2.3 最佳的草莓脱毒技术筛选

根据不同草莓脱毒处理后的存活率和草莓组培苗病原检测结果（表1、表2）进行分析，处理1检测到病毒，首先淘汰该技术；在处理2、处理3、处理4、处理5中均未检测到病毒，由于处理4试验处理后绝大部分种苗死亡，且还需高温设备，所以处理4不入选，处理2、处理3对操作要求严格，茎尖需剥离到0.2～0.5 mm的生长点，否则脱毒可能不完全（如处理1），处理5茎尖需剥离到0.2～0.5 mm的生长点，还需冷处理（操作也简单）脱毒，由此使得该处理脱毒充分、完全。因此，根据脱毒效果、操作要求综合考虑，处理5（直接茎尖培养+冷处理）是获得草莓脱毒种苗最佳的脱毒技术。

表1 不同处理对草莓组培苗存活的影响

表2 不同处理对草莓组培苗病原含量的影响

3 结论

在本试验研究中，通过5种处理方法获得的草莓组培苗，经检测后草莓种苗中的病原含量不同，比较分析筛选出了一种操作简便、脱病毒率高的草莓种苗脱毒技术，即为直接茎尖培养（0.2～0.5 mm茎尖生长点）+冷处理（组培苗置于5℃的冰箱中培养60 d）。该技术可推广应用于草莓脱毒种苗规模化育苗中，同时对其他作物的脱毒技术的研究与应用具有重要的参考价值。