人参皂苷Rg1调控TLR4/NF−κB信号通路抗重症肺炎大鼠心肌组织损伤的机制探讨

孙治霞，索红亮，李华，李宗尚，施光远

重症肺炎是一种发病率和致死率很高的呼吸系统感染病症，可引起组织器官严重缺血、缺氧，造成多器官功能损伤［1］；其中，心肌损伤是常见的肺外并发症之一，其持续性发展可导致患者心功能障碍和心力衰竭［2］。因此，如何降低重症肺炎对心肌细胞的损伤备受关注。人参皂苷Rg1是从中药人参中提取的一种三醇型皂苷，具有抗炎、抗疲劳和抗肿瘤等广泛的药理活性［3］。在心肌缺血再灌注损伤和糖尿病心肌病等疾病中人参皂苷Rg1可通过减轻心肌细胞凋亡和炎症反应对心肌损伤表现出较好的保护作用［4−5］，但关于人参皂苷Rg1对重症肺炎心肌损伤的作用研究鲜有报道。肺炎克雷伯菌是一种医院感染中常见的致病菌，可通过释放大量脂质体成分的菌膜促进内源性炎症反应的发生，造成包括心肌组织在内的多种器官损伤，气管注入其菌液是构建重症肺炎大鼠模型常用的建模方式［6−7］。本研究通过观察人参皂苷Rg1对重症肺炎大鼠心肌组织的影响，旨在揭示其抗炎和抗心肌细胞凋亡是否在抗重症肺炎心肌损伤中发挥作用，以期为重症肺炎心肌损伤的防治提供新线索。

1 材料与方法

1.1 主要材料肺炎克雷伯菌株（货号：ATCC13883，美国ATCC），清洁级体质量180～220 g SD大鼠［许可证号：SYXK（京）2017−0022，北京维通利华实验动物技术有限公司］；人参皂苷Rg1（货号：HG027162，宝鸡市辰光生物科技有限公司），B型钠尿肽（BNP）、肌钙蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（CK−MB）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：SEKR−0058、SEKR−0048、SEKR−0059，北京索莱宝），活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase−3）、非活化态含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3（procaspase−3）、Bcl−2、Bcl−2相关X蛋白（Bax）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、核因子−κB（NF−κB）p65和磷酸化（p）−NF−κB p65以及β−actin抗体（货号：ab214430、ab32150、ab182858、ab182733、ab13556、ab219413、ab237591、ab239882、ab8226，英国Abcam），实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（货号：RR047A，日本Takara Bio）。全自动数码凝胶成像分析系统（型号：Tanon 3500，上海天能科技有限公司），动物心功能分析系统（型号：MPA−CFS，上海奥尔科特生物科技有限公司），酶标仪（型号：Multiskan FC，美国赛默飞公司），脉搏血氧仪（型号：YX300，江苏鱼跃医疗设备有限公司），qPCR仪（型号：TL988，西安天隆科技有限公司）。

1.2 重症肺炎大鼠模型构建和分组处理模型构建［8］：采用戊巴比妥钠麻醉大鼠后，颈部剃毛消毒备皮；无菌条件下，切开颈部皮肤使上端器官暴露出来后，以注射器穿刺气管的方式注入以0.45%无菌盐水稀释制备的肺炎克雷伯菌溶液（1.2×109CFU/mL）0.3 mL，之后将大鼠直立保持30～40 s后进行伤口缝合和消毒。模型构建成功判断标准［9］：术后大鼠有呼吸急促和行动迟缓现象出现，同时以脉搏血氧仪检测大鼠后足血氧饱和度小于0.90。将构建成功的40只大鼠分为模型组和低、中、高剂量药物组，每组10只；另取10只未处理大鼠作为对照组。其中，低、中、高剂量药物组大鼠以2.5、5和10 mg/kg人参皂苷Rg1灌胃，模型组和对照组大鼠以等量生理盐水灌胃，每日1次，持续14 d。

1.3 苏木精−伊红（HE）染色法观察大鼠心肌组织病理形态并行积分统计麻醉处死大鼠后，取心肌组织；以4%多聚甲醛固定后制备石蜡切片并行常规的HE染色，在光学显微镜下观察大鼠心肌组织结构变化，并参照文献［10］方法统计大鼠心肌组织病理积分，即以心肌组织中坏死细胞及炎性细胞浸润面积与视野内总面积的百分比表示病变面积；病变面积≥75%记4分，50%～＜75%记3分，25%～＜50%记2分，＜25%记1分，无病变记0分。

1.4 心脏彩超检测大鼠心功能指标药物干预结束后，麻醉并固定大鼠，分离右侧颈总动脉，使用心脏彩超测定大鼠心功能指标，包括左室舒张压（LVDP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室最大舒张速率（−dP/dtmax）和左室最大收缩速率（+dP/dtmax）值。

1.5 ELISA法检测血清中BNP、cTnI和CK−MB含量大鼠处死后，开胸腔取左心室血液，以4 000 r/min离心10 min收集上清液，参照ELISA试剂盒说明书检测BNP、cTnI和CK−MB含量。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）检测心肌组织中白细胞介素（IL）−6、IL−1β和肿瘤坏死因子−α（TNF−α）mRNA水平采用Trizol法抽提心肌组织总RNA后，将其逆转录合成cDNA；以cDNA为模板，根据上海生工合成的引物在设定的扩增条件下进行PCR扩增。心肌组织中IL−6、IL−1β和TNF−α水平以2−ΔΔCt法计算，以β−actin为内参。扩增条件：95℃4 min；95℃15 s、58℃30 s，35个循环。IL−6：上游引物5'−ATTG‑TATGAACAGCGATGATGCAC−3'，下 游 引 物5'−CCAGG‑TAGAAACGGAACTCCAGA−3'，扩增片段长度为528 bp；IL−1β：上游引物5'−CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA−3'，下游引物5'−CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA−3'，扩增片段 长 度 为809 bp；TNF−α：上 游 引 物5'−GCCACCAC‑GCTCTTCTGTCT−3'，下游 引 物5'−TCTCCCTCCCCAACTCT CCT−3'，扩增片段长度为701 bp；β−actin：上游引物5'−CCCATCTATGAGGGTTACGC−3'，下游引物5'−TTTAATGT‑CACGCACGATTT−3'，扩增片段长度为252 bp。

1.7 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌组织中cleaved caspase−3、procaspase−3、Bcl−2、Bax、TLR4、MyD88、NF−κB p65和p−NF−κB p65蛋白表达水平向心肌组织中加入组织裂解液抽提组织总蛋白后，以二喹啉甲酸法检测蛋白浓度。将变性后的蛋白样品行电泳分离后，电转至聚偏氟乙烯膜上。以5%脱脂奶粉封闭1 h后，β−actin、cleaved caspase−3、procaspase−3、Bcl−2、Bax、TLR4、MyD88、NF−κB p65和p−NF−κB p65一抗4℃孵育过夜；辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h后，化学发光剂显影曝光。以β−actin为内参，采用凝胶成像分析系统扫描分析各组目的蛋白表达水平。

1.8 统计学方法采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，实验中所得数据均以均数±标准差（x±s）表示，以单因素方差分析对多组间数据进行比较，以SNK−q检验进行组间多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理形态和积分的比较对照组大鼠心肌组织中心肌细胞呈整齐排列，组织结构基本正常；模型组大鼠心肌组织中心肌细胞排列紊乱且肿胀变形，肌纤维部分断裂且伴随有炎性细胞浸润；相对模型组，低、中、高剂量药物组大鼠心肌组织中上述细胞形态变化明显改善，见图1。模型组大鼠心肌组织病理积分（3.55±0.42）较对照组（0.09±0.08）明显升高，低剂量药物组（2.63±0.36）、中剂量药物组（1.86±0.25）、高剂量药物组（0.79±0.11）大鼠心肌组织病理积分逐渐降低，且均低于模型组（n=10，F=248.641，P＜0.05）。

Fig.1 Pathological changes of myocardial tissue in each group(HE staining,×100)图1 各组大鼠心肌组织病理形态学变化（HE染色，×100）

2.2 人参皂苷Rg1对大鼠心功能的影响模型组大鼠心功能指标LVDP、−dP/dtmax以及+dP/dtmax较对照组明显降低，LVEDP明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量药物组LVDP、−dP/dtmax和+dP/dtmax显著升高，而LVEDP显著降低（P＜0.05），且随着药物剂量的升高，上述变化越明显。见表1。

2.3 人参皂苷Rg1对大鼠血清中BNP、cTnI和CK−MB含量的影响与对照组比较，模型组大鼠血清中BNP、cTnI和CK−MB含量均明显升高（P＜0.05）；但低、中和高剂量药物组BNP、cTnI和CK−MB含量明显低于模型组（P＜0.05），且随着药物剂量的升高，BNP、cTnI和CK−MB含量降低越明显。见表2。

2.4 人参皂苷Rg1对大鼠心肌组织中IL−6、IL−1β和TNF−αmRNA水平的影响与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中IL−6、IL−1β和TNF−αmRNA水平明显升高（P＜0.05）；低、中和高剂量药物组IL−6、IL−1β和TNF−αmRNA水平较模型组明显降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。见表3。

Tab.1 Comparison of cardiac function indexes between five groups of rats表1 各组大鼠心功能指标比较（n=10，x±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of BNP,cTnI and CK-MB between five groups of rats表2 各组大鼠血清中BNP、cTnI和CK-MB含量比较（n=10，x±s）

Tab.3 Comparison of mRNA levels of IL-6,IL-1βand TNF-αin myocardial tissue between five groups of rats表3 各组大鼠心肌组织中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平比较 （n=10，x±s）

2.5 人参皂苷Rg1对大鼠心肌组织中凋亡蛋白cleaved caspase−3、procaspase−3、Bcl−2和Bax表达的影响模型组中cleaved caspase−3/procaspase−3和Bax/Bcl−2比值较对照组明显升高（P＜0.05）；低、中和高剂量药物组中cleaved caspase−3/procaspase−3和Bax/Bcl−2比值逐渐降低，且均低于模型组（P＜0.05）。见表4、图2。

Tab.4 Comparison of cleaved caspase-3/procaspase-3 and Bax/Bcl-2 ratio in myocardial tissue of rats between five groups表4 各组大鼠心肌组织中cleaved caspase-3/procaspase-3和Bax/Bcl-2比值比较 （n=10，x±s）

Fig.2 The expression of procaspase−3,cleaved caspase−3,Bcl−2 and Bax protein detected by Western blot assay图2 Western blot检测procaspase−3、cleaved caspase−3、Bcl−2和Bax蛋白表达

2.6 人参皂苷Rg1对大鼠心肌组织中TLR4/NF−κB信号通路的影响模型组大鼠心肌组织中TLR4/NK−κB信号通路相关蛋白TLR4、MyD88和p−NF−κB p65表达水平较对照组明显升高（P＜0.05），低、中和高剂量药物组中TLR4、MyD88和p−NF−κB p65蛋白表达水平较模型组明显降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。见表5、图3。

Tab.5 Comparison of TLR4/NF-κB signaling pathway related protein expression levels in myocardial tissue of rats between five groups表5 各组大鼠心肌组织中TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平比较 （n=10，x±s）

Fig.3 The expression of TLR4/NF−κB signaling pathway related proteins detected by Western blot assay图3 Western blot检测TLR4/NF−κB信号通路相关蛋白表达

3 讨论

3.1 人参皂苷Rg1对重症肺炎心肌损伤的保护作用重症肺炎是一种常见的临床危重症，心肌损伤作为其常见并发症可导致患者心功能障碍甚至心力衰竭［11］。本研究在构建的重症肺炎大鼠中发现，大鼠心肌组织病理积分升高，心功能指标LVEDP升高，而LVDP、−dP/dtmax和+dP/dtmax降低；同时，大鼠血清中心肌损伤指标cTnI、BNP和CK−MB含量明显升高。结果表明，在构建的重症肺炎大鼠中，其心肌组织明显受损。以低、中和高剂量的人参皂苷Rg1干预后发现大鼠LVDP、−dP/dtmax、+dP/dtmax水平逐渐升高，而心肌组织病理积分、LVEDP和cTnI、BNP、CK−MB含量逐渐降低。结果表明，人参皂苷Rg1可呈剂量依赖性减轻重症肺炎大鼠心肌损伤，提示其对重症肺炎心肌损伤具有一定的保护作用。

3.2 人参皂苷Rg1可抑制心肌细胞凋亡和炎症反应重症肺炎患者处于一种严重的炎症状态，重症肺炎合并心肌损伤患者的炎症反应随着病原菌的复制和免疫力的下降，持续扩散至包括心肌组织在内的全身各个组织器官，而炎性细胞浸润又可引起心肌细胞变性坏死和凋亡，最终导致心肌组织损伤［12］。研究显示，人参皂苷Rg1可通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR−γ）介导的炎症反应来改善大鼠心肌缺血再灌注后的心律失常，还可通过降低钙敏感受体抑制心肌细胞凋亡［13−14］。本研究发现，重症肺炎大鼠的心肌组织中促炎因子IL−6、IL−1β、TNF−αmRNA表达水平和凋亡相关指标cleaved caspase−3/procaspase−3、Bax/Bcl−2比值明显升高，而给予低、中和高剂量的人参皂苷Rg1干预后，大鼠心肌组织中上述指标变化明显受到抑制。结果表明人参皂苷Rg1可抑制心肌组织炎症反应和心肌细胞凋亡，进而发挥对重症肺炎心肌损伤的保护作用。

3.3 人参皂苷Rg1可抑制TLR4/NK−κB信号通路活化TLR4是Toll样受体家族成员，可通过识别相应配体经MyD88激活NK−κB炎症通路促进炎性因子IL−6和IL−10等介质释放，在天然免疫、炎症反应和细胞凋亡等过程中发挥着重要作用，与心肌组织损伤的发生密切相关［15−17］。研究显示，人参皂苷Rg1可抑制TLR4/NK−κB信号通路的活化［18−19］。本研究发现重症肺炎大鼠的心肌组织中TLR4、MyD88和p−NK−κB p65蛋白表达水平明显升高；给予人参皂苷Rg1干预后，TLR4、MyD88和p−NK−κB p65蛋白表达水平呈剂量依赖性降低，表明人参皂苷Rg1可抑制重症肺炎大鼠心肌组织中TLR4/NK−κB信号通路的活化，提示其可能通过抑制该通路活化减轻炎症反应和心肌细胞凋亡，进而起到保护重症肺炎心肌损伤的作用。

综上所述，人参皂苷Rg1可通过减轻炎症反应和心肌细胞凋亡对重症肺炎心肌损伤发挥保护作用，其作用机制可能与抑制TLR4/NK−κB通路活化有关。本研究初步揭示了人参皂苷Rg1保护重症肺炎心肌损伤的作用通路，但是否还与调控其他通路有关仍有待进一步探讨。