PD−L1过表达在DENV−2诱导血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用机制

姚峰，朱磊，程波，杨明，刘敏

登革病毒（dengue virus，DENV）是引起登革热、登革出血热和登革综合征的病原体，为单正链RNA，属于黄病毒科，主要通过蚊虫（埃及伊蚊或白纹伊蚊）叮咬传播，流行于热带及亚热带地区［1］。DENV分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ血清型，其中以Ⅱ型登革病毒（dengue virusⅡ，DENV−2）传播最为广泛［2］。血管内皮细胞是DENV引起病变的主要部位之一，DENV可对血管内皮细胞造成损伤［3−4］。研究显示，DENV−2能诱导EAhy926细胞发生自噬［5］，通过线粒体途径诱导EAhy926细胞凋亡［6］。但具体的信号机制尚不明确。程序性细胞死亡受体−1配体（programmed death−1 ligand，PD−L1）是肿瘤免疫治疗的靶点之一，且参与细胞自噬活动［7−8］。但PD−L1是否与DENV−2诱导的人血管内皮细胞自噬和凋亡有关尚无定论。本文以EAhy926细胞为研究对象，观察PD−L1过表达在DENV−2影响血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料EAhy926细胞购自上海研酶生物科技有限公司；DENV−2病毒株购自北京义翘神州科技有限公司。DMEM/F12培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Hyclone公司；胎牛血清（FBS）、青−链霉素购自美国Gibco公司；自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3B（microtubule−associated protein1 light chain3B，LC3B）抗体、B淋巴细胞瘤−2（B−cell lymphoma−2，Bcl−2）抗体、自噬相关蛋白Beclin−1抗体、PD−L1抗体和α微管蛋白（α−Tubulim）抗体购自美国CST公司；羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG（IgG−HRP）二抗和羊抗小鼠IgG−HRP二抗购自美国圣克鲁斯公司；甘油醛−3−磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自武汉Bioworld公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PD−L1慢病毒载体过表达试剂盒购自上海吉玛公司。SpectraMax M5e多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司），Leica DMi8倒置荧光显微镜（德国Leica公司），Accuri C6 Plus流式细胞仪（美国BD公司），E−Gel Imager凝胶成像系统（美国Invitrogen公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养EAhy926细胞用DMEM/F12培养液（含10%FBS和1%青霉素−链霉素）置于37℃、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期用于后续实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活力收集对数生长期EAhy926细胞，以每孔100μL细胞悬液（0.9×107个/L）接种于96孔板中，过夜培养，次日吸出培养基加入含梯度浓度DENV−2（1×108、2.5×108、5×108、1×109、2×109pfu/L）的无血清DMEM/F12培养基；同时设置对照组和调零孔，对照组在细胞中加入无血清DMEM/F12培养基，调零孔在空白孔加入无血清DMEM/F12培养基。细胞处理24 h和48 h时每孔加入20μL MTT，放入培养箱继续培养4 h后每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min。酶联免疫检测仪于490 nm处测量各孔的吸光度（A）值，计算DENV−2处理组细胞增殖活力（%）=［（ADENV−2−A调零）/（A对照−A调零）］×100%，半数抑制浓度（50%concentration of inhibition，IC50）由Graphpad Prism7.0求得。实验共重复3次。

1.2.3 慢病毒转染法过表达PD−L1蛋白将EAhy926细胞接种至12孔板，细胞生长至50%融合度时转染。加入10 mg/L聚凝胺（polybrene）和10%FBS的DMEM培养基。载有PD−L1的慢病毒液和空载慢病毒液分别稀释50倍，各吸取50μL至细胞中，分别设为转染组和空载对照组。所有慢病毒液均载有绿色荧光标签。同时，以未转染的正常EAhy926细胞作为空白组。各组细胞置于培养箱培养18 h后更换为含10%FBS的DMEM/F12培养基，当细胞生长至90%融合度时以嘌呤霉素进行筛选。荧光显微镜下观察空白组、空载对照组和转染组慢病毒进入细胞情况；蛋白印迹法检测各组PD−L1蛋白表达情况。

1.2.4 蛋白印迹法检测蛋白表达据MTT结果，DENV−2对EAhy926细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）为1.2×109pfu/L，为后续实验浓度。DENV−2（1.2×109pfu/L）处理EAhy926细胞12 h、24 h、48 h作为DENV−2 12 h组、DENV−2 24 h组及DENV−2 48 h组，同时设置对照组；另一实验以DENV−2（1.2×109pfu/L）处理空载对照组和转染组48 h。收集各组细胞并提取总蛋白，以BCA试剂盒进行蛋白定量。各组以30 μg上样量进行10%SDS−PAGE，湿转PVDF膜，常温下以5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h，TBST缓冲液洗膜3次，以LC3B抗体（1∶1 000）、Bcl−2抗体（1∶2 000）、Beclin−1抗体（1∶2 000）、Tubulin抗体（1∶2 000）或PD−L1抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，再加入羊抗小鼠或羊抗兔IgG−HRP二抗（1∶2 000）室温杂交1 h，PVDF膜洗涤3次后以ECL化学发光试剂盒进行显色，凝胶成像仪进行成像。以Tubulin作为内参蛋白，用Image J（v1.8.0）对所有蛋白灰度值进行处理和分析，处理组目的蛋白相对表达量=（处理组目的蛋白灰度值/Tubulin灰度值）/（对照组目的蛋白灰度值/Tubulin灰度值）。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率分组同1.2.4。处理结束后将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，参考文献［9］和说明书进行Annexin V−PI染色，检测细胞凋亡情况。细胞总凋亡率（%）=第一象限百分率+第四象限百分率。

1.3 统计学方法采用Graphpad Prism 7.0软件对数据进行统计处理。符合正态分布的计量数据以x±s表示，2组间均数比较用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD−t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DENV−2抑制EAhy926细胞增殖与对照组比较，1×108、2.5×108、5×108、1×109、2×109pfu/L DENV−2处理24 h和48 h均可剂量依赖性抑制EAhy926细胞增殖（P＜0.01），见图1。DENV−2 24 h和48 h的IC50分别是1.8×109pfu/L和1.2×109pfu/L。

Fig.1 The effect of DENV−2 on the proliferation of EAhy926 cells图1 DENV−2对EAhy926细胞增殖能力的影响

2.2 DENV−2对EAhy926细 胞LC3B、Beclin−1及Bcl−2蛋白表达的影响与对照组比较，DENV−2（1.2×109pfu/L）处理12、24、48 h均可上调EAhy926细胞LC3Ⅱ/LC3I和Beclin−1蛋白表达，下调Bcl−2蛋白表达，呈时间依赖性（P＜0.05），见图2、表1。

Fig.2 The effect of DENV−2 on the autophagy in EAhy926 cells图2 DENV−2对EAhy926细胞自噬能力的影响

Tab.1 The expression levels of autophagy-related proteins in four groups of EAhy926 cells表1 各组EAhy926细胞自噬相关蛋白表达水平（n=3，x±s）

2.3 DENV−2对EAhy926细胞凋亡率的影响对照组、DENV−2 12 h组、DENV−2 24 h组及DENV−2 48 h组的EAhy926细胞凋亡率分别为（6.33±0.86）%、（12.05±1.50）%、（19.85±2.26）%、（27.30±0.03）%，呈依次增高趋势（n=3，F=160.000，P＜0.05），见图3。

2.4 PD−L1蛋白过表达验证与空白组比较，空载对照组和转染组细胞有较强的绿色荧光。空白组、空载对照组和转染组PD−L1蛋白相对表达水平分别为0.21±0.02、0.19±0.02和1.06±0.09，差异有统计学意义（n=3，F=249.400，P＜0.01），其中与空载对照组比较，转染组PD−L1蛋白表达明显上调（P＜0.05），空白组和空载对照组细胞差异无统计学意义，见图4。

2.5 过表达PD−L1对DENV−2诱导的细胞凋亡和自噬的影响DENV−2处理48 h后，与空载对照组比较，转染组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin−1蛋白相对表达水平下降，Bcl−2蛋白相对表达水平上升，细胞总凋亡率下降（P＜0.01），见图5、表2。

3 讨论

DENV可引起登革出血或登革综合征，可对血管内皮细胞造成损伤，而血管内皮细胞是DENV引起病变的主要部位之一［3−4］。因此，探讨DENV对血管内皮细胞的影响及相关机制具有重要意义。EAhy926细胞为重组血管内皮永生细胞，具有明显的血管内皮细胞特性，被广泛用于血管内皮细胞的相关基础研究。本研究以DENV−2（1×108～2×109pfu/L）处理EAhy926细胞，发现细胞增殖被抑制并呈剂量依赖性，提示DENV−2可能通过某种信号机制诱导细胞损伤，进而引起增殖抑制或细胞凋亡。

Fig.3 The effect of DENV−2 on the apoptosis of EAhy926 cells图3 DENV−2对EAhy926细胞凋亡的影响

Fig.4 Successful construction of PD−L1 overexpressing in EAhy926 cells图4 成功构建PD−L1过表达EAhy926细胞

Fig.5 The effect of overexpression of PD−L1 on DENV−2 induced apoptosis and autophagy图5 过表达PD−L1对DENV−2诱导的细胞凋亡和自噬的影响

Tab.2 Comparison of the expression levels of autophagy-related proteins and the total apoptosis rate between 2 groups of cells表2 2组细胞自噬相关蛋白表达水平及总凋亡率比较（n=3，x±s）

研究发现，细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但自噬细胞缺乏核固缩、核破裂、细胞皱缩、凋亡小体的形成等凋亡的典型特点，因此自噬又称为“Ⅱ型”或“自噬”非凋亡程序性细胞死亡［10−11］。自噬与凋亡程序均可调控细胞死亡［12］。研究认为，自噬与凋亡通路具有一些共用的信号蛋白，因此自噬和凋亡可产生相互影响［13］。激活自噬可以保护心脏免受心肌缺血和缺血后心脏重塑的影响，从而减轻心肌细胞凋亡［14］。另有研究显示，自噬可通过mTOR信号通路抑制高糖诱导的心脏微血管内皮细胞凋亡［15］。因此，自噬参与心血管内皮细胞的凋亡过程。最近的研究显示，DENV−2可诱导细胞间黏附分子−1表达上调和自噬，最终诱导人肝窦内皮细胞凋亡［16］。DENV−2能诱导人血管内皮细胞EAhy926发生自噬［5］，并通过线粒体途径诱导人血管内皮细胞EAhy926凋亡［6］。

LC3Ⅱ与LC3Ⅰ是LC3B的2种水解形态，当细胞发生自噬时LC3Ⅱ与LC3Ⅰ蛋白表达比值升高［17］。Beclin−1是自噬关键调控蛋白之一，参与自噬 体 膜 形 成；Bcl−2可 与Beclin−1结 合 并 抑 制Beclin−1的活性，Bcl−2也是经典的凋亡抑制蛋白，其表达下调与细胞凋亡增加有关［18］。本研究增殖实验显示，48 h时DENV−2对EAhy926细胞的IC50为1.2×109pfu/L，由于此时细胞存活和死亡细胞均占50%，有利于观察自噬和凋亡相关指标，因此选取此浓度进行后续实验。本研究结果显示，与对照组比较，DENV−2处理12 h、24 h、48 h均可上调EAhy926细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin−1蛋白表达，下调Bcl−2蛋白表达；流式细胞术结果显示，对照组、DENV−2 12 h组、DENV−2 24 h组 及DENV−2 48 h组 的EAhy926细胞凋亡率呈依次增加趋势，表明DENV−2可能通过调控Bcl−2/Beclin−1通路上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，进而诱导EAhy926细胞自噬和凋亡，而Bcl−2作为关键蛋白，其表达下调同时导致自噬和凋亡的增强，可能是DENV−2诱导血管内皮细胞损伤的潜在治疗靶点。

PD−L1为PD−1的配体，两者结合所组成的免疫检查点可抑制T细胞的活化及细胞因子的产生［7］。在血管内皮细胞、胰岛细胞以及免疫豁免部位（如胎盘、睾丸和眼睛）等非造血细胞PD−L1表达水平较低［19］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTORC1）是细胞自噬中的重要调控靶点，其激活能抑制细胞自噬［20］。在肿瘤免疫调控实验中发现，肿瘤细胞固有的PD−L1可促进MTORC1信号激活，从而促进肿瘤细胞生长，使肿瘤细胞自噬活动处于“静息状态”［21］。为观察PD−L1在DENV−2诱导EAhy926细胞自噬和凋亡中的作用，本研究以慢病毒为载体外源性上调EAhy926细胞PD−L1蛋白表达，并以嘌呤霉素筛选了稳定表达的细胞，结果发现，PD−L1过表达后DENV−2对EAhy926细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin−1及Bcl−2蛋白表达的诱导被逆转，且细胞凋亡明显减少，表明过表达PD−L1能抑制DENV−2诱导的EAhy926细胞自噬和凋亡，而该作用可能与抑制Bcl−2/Beclin−1信号通路有关。

综上所述，DENV−2可能通过Bcl−2/Beclin−1通路上调LC3Ⅱ/LC3I，进而诱导EAhy926细胞自噬和凋亡。PD−L1过表达可逆转DENV−2的上述诱导效应，这可能是DENV−2诱导血管内皮细胞损伤的保护靶点。PD−L1与自噬的相关性研究丰富了PD−L1蛋白的生物学功能，但PD−L1的下游信号靶点还未完全清楚，有待于更多实验验证。