我国水稻重要农艺性状分子遗传研究进展及在育种上的应用

李潜龙 王慧,2 方玉,2 张从合,2*

（1 上海中科荃银分子育种技术有限公司，上海 200233；2 安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交水稻新品种创制重点实验室，合肥 230088；*通迅作者：zhangch7201@vip.sohu.com）

水稻（Oryza sativa L）是我国的主要粮食作物，具有悠久的种植历史，诗经记载“丰年多黍多稌”，其中“稌”即为糯稻。我国水稻发展经历两次巨大的飞跃：一是20世纪60年代半矮秆化水稻品种革命，使水稻单产提高20%以上；二是在20世纪70年代开发的三系和细胞质雄性不育系统的杂交水稻品种，使水稻平均产量又大幅度提高了20%[1]。然而，随着耕地面积的不断减少、环境污染加剧、生态环境压力逐渐增大以及人们生活水平的不断提高，对水稻生产又提出了新的要求，不仅要高产、抗病、抗倒伏，还要求优质。预计到2030年，我国人口将会达到16.5亿，粮食生产将产生巨大的缺口。在这种情况下，传统的育种技术已经很难满足当前水稻生产的需要，寻找新的水稻育种技术迫在眉睫。常规育种技术是通过表型间接选择基因型，一般只对质量性状有效，而对数量性状则效果不明显。这是由于数量性状的连续变化是由多基因和环境因素控制的。近几十年来，分子标记、转基因技术和基因组学技术的进步对传统水稻育种的概念和手段产生了深远的影响，使得分子育种技术在水稻上的应用成为可能。分子育种是现代生物技术手段与传统育种方法的结合，用于开发水稻新品种。主要涉及利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因存在的分子标记辅助选择育种（MAS）和将特定的目的基因与转化载体进行体外重组，然后转入水稻中进行稳定的整合、表达和遗传的基因工程育种（GEB）[2]。

21世纪初，我国开始了水稻功能基因组学的研究，一批与水稻重要农艺性状相关的数量性状位点（QTL）/基因、基因组变异和单倍型的克隆，为水稻的直接选择和分子育种提供了坚实的基础。

1 水稻重要农艺性状基因的克隆

1.1 水稻产量相关基因的克隆

水稻产量性状是由多基因控制的复杂数量性状，受自然环境影响较大。水稻的产量构成主要分为单位面积有效穗数、每穗粒数和粒质量[3]。其中，有效穗数决定于每株水稻的有效分蘖，MOC1是我国科研人员克隆的首个调控水稻分蘖的基因，MOC1突变体由于不能形成分蘖芽而只有主茎没有分蘖，该基因编码GARS家族的核蛋白，过表达则分蘖数增加、株高变矮[4]。叶原基形成间隔期调控基因（PLA1）编码细胞色素P450 CYP78A11，可以调节营养生长期叶片起始发育的速率，影响叶片数和分蘖数，从而调节有效穗数。PLA1还可以通过调节一次枝梗的发育来影响穗数[5]。

水稻的粒质量主要是由粒长、粒宽、粒厚以及籽粒灌浆的充实度来决定。GS3是水稻中克隆的第1个与粒长和粒质量有关的主效QTL，同时也是控制水稻粒宽和籽粒充实度的微效QTL。它包括N端的OSR结构域、1个跨膜区、TNFR/NGFR家族富半胱氨酸结构域、以及C端的VWFC，通过负调控颖壳细胞数目来控制水稻的粒长[6]。GW2基因编码1个环型E3泛素连接酶，位于细胞质中，通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解，从而负调节细胞的分裂。其功能丧失不能将泛素转移到靶蛋白上，因而使得本应降解的底物不能被特异识别，从而激活颖花外壳细胞的分裂，导致颖壳变大，间接地，灌浆速率加快，最终使粒宽和粒质量增加，进而产量得到提高[7]。2015年，傅向东课题组和李家洋课题组同时发表论文，揭示了1个控制水稻粒型的基因GL7，该基因编码拟南芥LONGIFOLIA蛋白的同源蛋白，而LONGIFOLIA能调节细胞的纵向伸长，GL7位点发生了17.1kb的DNA大片段串联重复，这一基因组结构变异导致了GL7基因表达量的上升，同时还引起了其临近的负调控因子表达的下调，引起粒长增加，垩白度和垩白率降低，从而显著改善稻米外观品质[8-9]。此外，GW5[10]、GW8[11]、GS5[12]、qTGW3[13]等基因均能调控水稻的产量性状。

2010年，李家洋院士团队克隆了控制水稻理想株型形成的主效基因IPA1，该基因编码1个含有SBPbox结构域的转录因子，调控多个生长发育过程，其功能获得性突变体具有无效分蘖少、茎秆粗壮抗倒伏、穗大粒多产量高等优异农艺性状[14]。2018年，陈学伟研究小组发现，IPA1不仅促进正常条件下水稻的生长，而且在受到稻瘟病菌侵染时受诱导磷酸化而增强免疫反应，这一机理使得在含有IPA1的功能获得性基因型的水稻中，产量和稻瘟病抗性同时得到提高，这种机制打破了单个基因不可能同时实现增产和抗病的传统观点，为高产高抗育种提供了重要理论基础和实际应用新途径[15]。

1.2 水稻品质相关基因的克隆

水稻品质主要由外观品质、加工品质、蒸煮品质、食味品质及营养品质共同决定。初期研究水稻品质相关的基因是胚乳中淀粉合成相关基因，包括控制蔗糖合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶等的基因。这些基因通过影响直链淀粉含量高低来影响稻米的食味品质。上世纪90年代，洪孟民院士率先克隆了水稻蜡质基因Wx，该基因是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响水稻胚乳和花粉中直链淀粉的含量[16]。蜡质基因的克隆揭示了糯稻与非糯水稻形成的分子机理，对我国稻米品质改良具有重要意义。2014年，华中农业大学的何予卿课题组克隆了1个影响水稻籽粒垩白的基因Chalk5，该基因编码1个液泡质子转运焦磷酸酶（V-PPase），具有无机焦磷酸盐（PPi）水解活性和质子转运活性，影响水稻籽粒垩白的形成和精米率等品质性状。提高该基因的表达量可以增加胚乳垩白，可能是通过干扰发育中种子内膜转运系统的pH稳态来实现。这个过程影响了蛋白体的形成并且与囊泡类结构显著增加相耦连，因此在胚乳储存物质中形成了气体空间，从而导致了籽粒垩白的形成[17]。同年，何予卿课题组又鉴定了1个控制籽粒蛋白含量的关键基因qPC1，其通过调控谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白和淀粉的合成与累积来调控水稻籽粒蛋白质含量[18]。2019年扬州大学严长杰课题组克隆了1个控制稻米蛋白质总含量的关键基因Os－GluA2（qGPC-10），该研究团队对400多份水稻种质资源的总蛋白以及贮藏蛋白含量分别进行测定，确定了胚乳中谷蛋白含量的变异是水稻总蛋白变异的决定因子；在不同环境中同时鉴定出了2个能够稳定遗传的控制水稻蛋白质含量的关键QTLs，并通过图位克隆与功能研究明确了qGPC-10（OsGluA2）能够显著影响稻米蛋白质含量并最终影响稻米的营养品质[19]。水稻香味是评价水稻品质的重要指标之一，香味基因Os－BADH2（fgr）编码甜菜碱醛脱氢酶，其功能丧失能够导致香味物质2-乙酰基-1-吡咯啉不断积累，形成具有香味的水稻叶片和籽粒[20]。除此之外，还有GW8[11]、FLO6[21]、GIF1[22]等基因通过不同的途径调控稻米的品质。

1.3 水稻抗病虫害相关基因的克隆

稻瘟病、白叶枯病和纹枯病是影响水稻生产的三大病害，严重时可导致大面积减产甚至绝收。早在2004年，华中农业大学王石品课题组鉴定了水稻白叶枯抗病基因Xa26，该基因在粳稻中具有广谱且持久的抗性[23]。最新研究表明，水稻磷酸丙糖异构酶TPI1.1通过与Xa3/Xa26结合增强自身酶活，通过调节体内活性氧的含量来参与Xa3/Xa26介导的白叶枯抗病途径[24]。2014年，中国农业科学院万建民院士课题组克隆了水稻中首个抗条纹叶枯基因STV11，该基因的抗病等位基因STV11-R编码1个磺基转运酶OsSOT1，该酶催化水杨酸（SA）转化为磺化水杨酸，从而使水稻对条纹叶枯病毒具备持久抗性，而感病等位基因STV11-S失去这种活性[25]。目前为止，水稻中报道了40多个水稻抗白叶枯病QTL位点，其中被克隆的有11个基因，包括Xa1[26]、Xa3/Xa26[23]、Xa4[27]、Xa5[28]、Xa10[29]、Xa13[30]、Xa21[31]、Xa23[32]、Xa25[33]、Xa27[34]、Xa41[35]。2017年，广谱持久抗稻瘟病基因Pigm被报道，揭示了水稻广谱抗病性与产量平衡的表观遗传调控新机制，为解决作物高抗与产量之间的矛盾提供了新理论[36]。2018年陈学伟课题组在《Science》上发表了水稻理想株型关键基因IPA1在水稻抗稻瘟病过程中的作用，IPA1结合DEP1等穗发育相关基因的启动子，促进其表达，调控水稻理想株型的建成与水稻产量；受稻瘟病菌诱导后，IPA1发生磷酸化修饰并改变其与DNA序列的结合特性，使得IPA1结合抗病相关基因WRKY45的启动子，促进其表达，增强免疫反应，提高抗病性[15]。2019年万建民院士团队报道了1个水稻稻瘟病抗性的“闸门”基因OsCNGC9，该基因对稻瘟病抗性具有正向调控作用，能够介导PAMP诱导Ca2+内流，这对于PAMPs触发的ROS爆发和诱导PTI相关防御基因表达具有重要作用。进一步研究表明，PTI相关的受体样胞质激酶Os－RLCK185能够与OsCNGC9互作，并通过磷酸化修饰改变其通道活性，揭示了OsCNGC9在介导细胞质钙离子升高和水稻抗病中的作用，为水稻稻瘟病抗性改良育种提供了重要的材料和新的理论基础[37]。

褐飞虱是一种主要的水稻害虫，每年造成水稻产量的大量损失。BPH14是水稻中克隆的第1个抗褐飞虱的主效基因，该基因编码一种具有卷曲螺旋、核苷酸结合以及富含亮氨酸重复序列的蛋白，通过激活水杨酸（SA）信号传导途径来介导对褐飞虱的抗性[38]。2015年，万建民院士团队报道了抗褐飞虱基因BPH3，1个编码3种质膜凝集素激酶受体的基因簇，它们共同发挥作用，赋予广谱和持久的抗虫性[39]。迄今为止，已从栽培稻和野生稻中鉴定出至少35个抗飞虱基因，其中Bph14、Bph3、Bph18、Bph26、Bphi008a和Bph29已被克隆[40]。

1.4 水稻耐逆相关基因的克隆

水稻在生长过程中，不仅会受到虫害、病害和杂草危害等生物逆境胁迫，还会受到洪水、干旱、高温、低温以及土壤盐碱化和重金属污染等非生物逆境胁迫。近年来，水稻非生物抗逆性分子育种研究得到了一系列重要的进展，发现并克隆了一些基因和QTL，这些基因和QTL在水稻抗逆性育种中具有较高的应用潜力。2015年，中国科学院林鸿宣课题组克隆了第1个耐高温的QTL基因OsTT1，该基因编码1个参与泛素化蛋白降解的26S蛋白酶体α2亚基。泛素化组学分析表明，OsTT1通过更有效降解有毒变性蛋白以及维持高温应答过程，进而保护植物细胞[41]。同年，种康课题组在粳稻中鉴定到了1个水稻重要耐寒性QTL基因COLD1，冷处理时，COLD1与G-蛋白α 亚基RGA互作，激活Ca2+通道，触发下游耐寒防御反应，而后加速G蛋白GTP酶活性以平衡G蛋白动态活性[42]。2016年，薛勇彪课题组克隆了1个新的水稻耐热关键基因TOGR1，该基因编码一种温度介导和节律调控的DEAD-Box RNA解旋酶，TOGR1参与高温条件（25℃～40℃）下正常rRNA前体的加工，是细胞核仁SSU复合体的伴侣蛋白，对高温下的细胞增殖十分重要，调控水稻耐热生长[43]。2019年，中国科学院陈彩艳课题组与湖南杂交水稻研究中心袁隆平团队克隆了1个水稻抗寒关键基因HAN1，该基因编码1个氧化酶，能催化有生物活性的茉莉酰-L-异亮氨酸（JA-Ile）转化为非活性形式12羟基-茉莉酰-L-异亮氨酸（12OH-JA-Ile），并微调JA介导的冷冻反应[44]。

盐胁迫是造成水稻减产的重要环境因素之一。2005年，林鸿宣课题组在水稻中克隆了第1个耐盐QTL基因skc1,该基因编码1个HKT家族的钠离子转运蛋白，主要集中在木质部，地上部多余的Na+通过木质部卸载回流到根部，从而降低Na+的毒性，增强水稻耐盐性[45]。2018年，湖南大学刘选明课题组发现1个可以在盐胁迫条件下明显提高水稻耐盐性和产量的类受体胞质激酶基因STRK1，STRK1在受到高盐渗透后发生自磷酸化，并通过磷酸化与其相互作用的过氧化氢酶C的210位的酪氨酸残基，显著提高过氧化氢酶活性，从而将过量有害的过氧化氢分解为水和氧气，降低高盐渗透造成的危害，提高水稻耐盐性和产量[46]。

镉是环境毒性污染的重金属元素之一，水稻容易吸收和积累镉元素，人体摄入镉超标的大米会严重危害身体健康。2018年龚继明课题组克隆了1个水稻叶片镉积累的关键基因CAL1，该基因编码植物防御素类似蛋白，通过螯合镉并将其排除出细胞来降低细胞内的镉浓度[47]。2019年，何振艳课题组采用全基因组关联分析鉴定到了1个参与镉转运的主要协助转运蛋白超家族成员OsCd1。该研究发现了参与水稻镉吸收和籽粒镉积累的OsCd1基因及其低镉积累的自然变异Os－Cd1V449，对水稻镉积累分子机制的阐释和低镉水稻品种的培育具有重要参考[48]。随着基因组学的发展，越来越多参与调控水稻镉积累的基因被克隆，如OsHMA3[49]、OsPDR5[50]、LCD[51]、OsMTP1[52]等。

2 水稻重要农艺性状基因的应用

2.1 在提高产量上的应用

为了提高粮食产量，保证粮食安全，我国科学家采用分子育种的方法在水稻产量的提高上取得了显著成就。李家洋院士团队将IPA1导入优质籼、粳稻骨干亲本中，充分利用籼粳杂交稻的杂种优势，将杂种优势和理想株型相结合，聚合了控制理想株型、抗稻瘟病、结实率、生育期等优异性状的等位基因，育成适宜长江中下游稻区种植的“嘉优中科”系列水稻新品种[53]。郭龙彪等通过分子标记辅助选择育种（MAS）将控制粒重的基因GW6转入籼稻品种9311中，构建近等基因系，从中选择出1个优良品系，该品系相对于轮回亲本9311粒长和粒质量分别增加了11.0%和19.0%，单株产量增加了6.7%[54]。

2.2 在品质改良上的应用

随着人们生活水平的提高，人们对稻米品质的要求也越来越高。王岩等把中国香稻的alk和fgr等位基因片段通过回交聚合的育种方法导入明恢63中，改良后的明恢63表现出明显的低糊化温度（GT）、高凝胶浓度（GC）、垩白度降低、香味增加，稻米外观、蒸煮和食味品质均得到显著提高[55]。高产优质杂交稻中优161是庄杰云等利用分子标记辅助育种（MAS）选育出的恢复系中恢161（携带有利等位基因wx），与不育系中9A配组而成[56]。LIU等采用PCR-AccI分子标记，将Wxb基因导入籼型杂交稻亲本龙特甫和珍汕97中，在后代中选育出低直链淀粉含量的改良保持系和恢复系[57]。

2.3 在提高水稻抗病虫害方面的应用

白叶枯病突发性强，且传播和侵染速度快，一旦暴发，便很难控制。为了提高水稻对白叶枯病的抗性，曹立勇等采用分子标记辅助选择的方法在带有抗白叶枯基因XA21的材料IRBB21和感病品种IR24的杂交后代中选育出具有抗白叶枯病基因Xa21的恢复系中恢8006，并配制出优质高产抗病杂交稻国稻1号[58]。邓启明等利用 IRBB60（Xa21、Xa4、Xa13、Xa5）、WBB1（Xa23）、感病品种绵恢725为材料，采用复合杂交结合分子标记辅助选择技术（MAS）得到聚合Xa21、Xa23和Xa4的杂交水稻优良恢复系绵恢725[59]。黄大辉等用抗稻瘟病品种合丰占与抗白叶枯病品系粤泰占杂交，经过多代自交选育，结合分子标记辅助选择技术(MAS)，选育出聚合了多个抗稻瘟病基因（Pi-ta、Pib、Pi54）和抗白叶枯病兼抗细条病基因Xa5的优质、多抗恢复系桂恢663[60]。

稻瘟病每年都会造成粮食的大量减产，为了选育出高抗稻瘟病的水稻新品种，世界各国的水稻育种专家开展了大量的工作。刘雄伦等以谷梅4号和湘晚籼13为材料，通过连续回交、自交及分子标记辅助选择（MAS），培育出含有Pigm纯合等位基因、高抗苗瘟和穗瘟，且农艺性状与湘晚籼13高度相似的BC株系，实现了稻瘟病抗性的定向改良目标[61]。朱旭东等以C101LAC和C101A51为稻瘟病抗性基因的供体亲本、金23B为受体亲本，通过杂交、复交及一次回交，在分离世代利用分子标记辅助选择技术（MAS），获得了带有Pi-1、Pi-2和Pi-33基因的金23B导入系，对稻瘟病具有明显的抗性[62]。倪大虎等通过分子标记辅助选择技术（MAS）与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9(t)基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到了同一株系中[63]。

自上个世纪70年代以来，各国科研工作者都展开了水稻抗飞虱基因的发掘与育种应用工作。朱永生等以抗褐飞虱材料B5（携带Bph14和Bph15）及携带白背飞虱抗性位点qsI-4的籼型恢复系水稻品种福恢7011为供体亲本、以骨干恢复系福恢676为轮回亲本，采用低世代分离群体田间表型结合单株鉴定与高世代稳定株系室内筛选和分子标记辅助选择（MAS）相结合的方法，并对抗虫株系及其测交后代进行考查和农艺性状分析，选育出聚合Bph14、Bph15和qsI-4的恢复系材料[64]。徐鹏等以R1813为父本，利用分子标记辅助选择（MAS）和回交转育技术，将MD12086-41中携带的稻瘟病抗性基因Pi9、白叶枯病抗性基因Xa23、褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15渗入到R1813得到聚合3种抗性基因的改良系[65]。

2.4 在提高水稻的耐逆性方面的应用

我国的盐碱（渍）地面积大约9 913万hm2，其中严重盐渍化土壤大约3 667万hm2，是世界盐碱地大国。因此，开展水稻耐盐研究，通过遗传改良胁迫选择提高水稻的耐盐性，选育出耐盐水稻品种将使盐碱稻作区的生态环境得到有效改善，使粮食生产安全得到保障。江苏省农业科学院等单位通过分子标记辅助选择（MAS）与常规育种技术相结合，建立耐盐、优质、抗病、高产多基因聚合育种技术体系，将优质、抗病、高产、耐盐基因聚合到优良水稻品种中，育成适宜沿海滩涂种植的耐盐水稻品种南粳9108等[66]。郭龙彪等通过基因工程的方法将CMO、BADH、mtlD、gutD和SAMDC导入秀水11中，得到9份耐盐的优良株系或中间材料[67]。2018年全国“海水稻”区域试验，共有28个品种表现较好。

3 利用基因工程创制水稻新材料

传统的水稻育种技术很难将这些功能基因快速利用起来，而水稻基因工程育种是利用基因工程的手段，有目的地将外源基因导入水稻基因组，通过直接表达外源基因，或调控内源基因的表达甚至调控植物相关基因的表达，快速、高效的使水稻获得新性状的一种新的水稻品种改良技术。基因工程技术为水稻新品种的培育提供了一个崭新的途径，可以实现物种之间遗传物质的转移[68]。中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室通过转基因的方法将MOC1转基因纯系与中超123杂交，获得了大量分蘖少、农艺性状优良、具有高产潜力的中间材料。龙起樟等以广泛使用的杂交水稻亲本华占和五丰B以及常规水稻品种五山丝苗和中早35为材料，采用CRISPR/Cas9技术将OsNramp5基因敲除，得到的基因敲除株系籽粒镉含量低于0.1 mg/kg[69]。胡昌泉等采用农杆菌介导法将可溶性淀粉合成酶III基因（OsSSIIIa）和淀粉分支酶IIb基因（OsBEIIb）导入籼稻恢复系明恢86中，可有效的降低直链淀粉含量[70]。胡燕等利用农杆菌介导法将Pi-d2基因转入籼稻品种蜀恢527中，增强了其对稻瘟病的抗性[71]。向殿军等利用转基因技术将拟南芥ICE1基因导入垦鉴稻10号中，显著提高了该品种的耐寒性[72]。朱宝成等利用转基因技术将大麦的LEA3基因转入水稻中，并对转基因植株进行了抗渗透胁迫能力分析，结果证明，在环境胁迫条件下，导入LEA3基因的植株可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及SOD活性均高于对照[73]。刘耀光等利用Cre/loxP重组系统和新创建的不可逆重组的突变loxP位点，开发了新一代的高效多基因载体系统TGS II（TransGene Stacking II）。通过使用该系统，成功把花青素合成相关的8个关键基因转入水稻，实现了花青素在水稻胚乳特异合成，创造出首例富含花青素的水稻新种质“紫晶米”[74]。王克剑等利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在春优84中敲除了4个水稻生殖相关基因（PAIR1、REC8、OSD1和MTL），使杂交稻产生了无融合生殖性状，并产生了与杂交稻一样的克隆种子；进一步检测确定，通过克隆种子培育的子代植株与一代杂交稻高度相似。该研究证明了杂交稻进行无融合生殖的可行性[75]。周焕斌等利用腺嘌呤碱基编辑器rBE14工具，对水稻α-微管蛋白基因OsTubA2进行了定点核苷酸编辑，获得了对靶标除草剂二甲戊灵耐受水平达到推荐剂量的3倍、对氟乐灵也有较好的耐受性的水稻新种质[76]。

4 展望

近十几年中，我国水稻科研工作者在水稻分子育种中取得了瞩目的成就。不仅克隆解析了一批调控水稻产量、品质、抗病、抗虫和耐逆的基因，还将这些基因运用于水稻育种，培育出一系列适应当代种植环境的水稻新品种。而且基因编辑技术也将成为一种高效的分子育种途径。与传统的杂交育种方法相比，它能缩短聚合优异基因的时间，并且可以得到更加丰富的遗传种质资源。未来，随着育种的理论和技术水平不断提高、基因组学技术的不断发展，水稻分子育种相关的种质资源信息将不断完善，将会为水稻分子设计育种提供坚实的基础。水稻育种从常规育种向分子设计育种发展是一个大趋势，从产量、品质、选择效率、抗病虫性、耐逆性等方面改善水稻的农艺性状，为保护国家粮食安全和环境安全做出进一步贡献。