人类辅助生殖技术用医疗器械精子毒性检验

【作 者】连环，陈虹，韩倩倩

中国食品药品检定研究院，北京市，102629

0 引言

为配合人类辅助生殖技术的发展，人类辅助生殖用医疗器械的开发层出不穷，其涵盖了所有与精子、卵母细胞或胚胎直接或间接接触的培养基类及器具/耗材类产品，而精子毒性检测是此类产品安全有效性评价中不可或缺的一环。现有的YY/T 1535规定了人精子存活试验的相关细节[1]，但对于其不适用的精子优选类和精子制动类产品还需进一步探索各自特定的性能指标及检测方法。同时为了加快产品检验流程，避免对人精子资源的浪费和伦理审查之类的烦琐流程，人精子替代试验也是值得关注的方向。

1 人类辅助生殖技术及相关医疗器械的种类、风险与监管

人类辅助生殖技术（human assisted reproductive technology，ART）是20世纪70年代兴起的，通过运用医学技术和方法对配子、合子、胚胎进行人工操作，从而使不育夫妇妊娠的技术，涵盖了人工授精（artificial insemination,AI）和体外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer,IVF-ET）技术及其各种衍生技术[2-4]。ART相关医疗器械类产品主要有各种培养液、冲洗液、缓冲液、冷冻液等培养基类产品；还有各种培养皿、取卵针、显微注射针以及其胚胎移植导管等耗材器具类产品。这些产品在ART操作过程中均与人类配子和/或胚胎发生直接或间接接触，因此不孕不育患者在使用它们的同时也面临着巨大的风险，因为其安全性不仅影响着患者，还有可能影响患者后代的健康和发育安全[5-6]。综上所述，亟须对此类产品加大监管力度，以保障广大民众的用械健康，而我国也对ART相关医疗器械给予了高度的重视，并建立了特殊的监管体制[7-9]。由于目前在我国市场上使用的各类产品中培养液及保存液类产品主要为进口产品，国内大多数生产企业还处于起步阶段但发展迅速，多数产品现处于申请注册前检验或申请注册阶段，所以我国也正在积极推进人类辅助生殖技术用医疗器械的标准化工作，以期为相关产品的顺利注册以及行业的健康发展保驾护航[10-12]。

2 相关器械针对人精子的安全性检测以及功能性检测

2.1 人精子存活试验是可用于大多数产品安全性的检测试验

ART类医疗器械的安全性评价因为其临床用途的特殊性，往往需要增加其对人类配子（如精子）的影响。2017年国家食品药品监督管理局就发布了《人类体外辅助生殖用医疗器械 生物学评价 人精子存活试验》（YY/T 1535-2017），用于评价ART器械中与精子、卵母细胞或胚胎直接接触的培养基类及器具/耗材类产品可能产生的毒性风险[1]。人精子存活试验就是利用人类精子与供试品或其浸提液共孵育后人精子活力的变化来间接判断受试物对精子、卵子或胚胎的潜在毒性，其中对于人精子的活力用试验中前向运动精子（progressive motility，PR）占全部精子（前向运动，不活动和非前向运动精子的总和）数量的百分比来表征，也即：精子活力=（前向运动精子/精子总数）×100%。

但值得注意的是，此试验并不适用于精子制动液（因为其造成精子运动能力的明显下降）、透明质酸酶（影响精子膜进而影响精子运动）及配子/胚胎冷冻复苏液（明显不利于精子运动）等产品的检测。

2.2 对于人精子存活试验不适用的产品可根据其产品特性制定其功能性试验

对于以上这些ART产品，可采用鼠胚试验替代人精子存活试验[13]，且应当根据其各自特殊的功能，研究增加其特定的性能指标，制定相关功能性检测试验及相关标准。比如说在《人类体外辅助生殖技术用液注册技术审查指导原则》中就规定了，对于精子密度梯度分离液等密度梯度离心介质及组织培养油，还需制定其密度指标[14]；组织培养油和精子制动液等产品还需制定其黏度要求等理化指标。同时对于精子密度梯度分离液等精子优选产品应制定活动精子回收率、处理后精子活力提升率等指标，精子制动液也应制定精子制动性能等功能性指标[15-16]。

精子活力提升试验是基于存活试验的拓展，通过模拟精子优选类产品的临床使用过程，来研究经过产品处理后及处理前的精子活力的差异——精子活力提升率，也即：精子活力提升率=处理后精子活力-处理前精子活力。

并根据活力提升率的大小来说明相关产品是否能实现其描述的功能[17-18]。当然对于此类产品，仅仅是精子活力提升率一个指标还不足够，因为如果其使得精子数目剧烈下降而不足以满足临床使用要求时，该产品的有效性也是值得商榷的[19-20]。因此我们添加了另一个指标——活动精子回收率，也即：活动精子回收率=（处理后活动精子总数/处理前活动精子总数）×100%。

通过这两个指标，就可以比较完整地描述精子优选类产品的有效性。

而精子制动类产品的主要功能是在对精子进行显微操作时人为降低精子活动力从而达到便于操作的目的，因此评价方法与指标也要做出相应调整[21]。需要注意的是，此时我们选择的表征量是精子活动力而不是精子活力，因为精子活力的定义仅仅是试验中前向运动精子占全部精子数量的百分比，不足以细节化描述精子运动情况[22-23]。精子活动力一般用精子的直线运动速率表示，可通过显微镜同计数板配合进行目视测量，也可使用计算机辅助分析系统（computer-aided sperm analysis,CASA）对其进行更快捷、客观计量[24-26]。类似于精子优选类产品，精子制动类产品的制动性能可通过经产品处理后的精子活动力或者精子制动率来表示，也即：精子制动率=（处理后精子活动力/处理前活动活动力）×100%。

这些功能性试验不仅仅可以验证相应产品的安全性，还可以间接反映其有效性，因此也是未来试验开发重点研究方向。

3 关于人精子试验替代方法的探索

ART的出现改变了人类传统生育方式，在造福人类的同时也带来了诸多伦理道德和社会法律问题，精子携带着人体一半的核酸信息，具有同卵子结合后发育成完整个体的潜能，因此涉及精子的使用往往需要通过多道伦理审查程序[7-9]。而且国内精源短缺的现象十分普遍，在捐献精子人数有限的情况下，使得众多不孕不育家庭顺利得到解决仍是个严峻的问题，因此业内也有人表示采用人精子进行相关试验是一种对资源的浪费[27-29]。此时，寻找一个可替代的动物精子模型也成了新的发展趋势。作为常见的家畜，猪牛兔的精子来源比较可靠，且其外部形态与人精子无明显差异，均具有头、颈、尾三个部分[30-31]。根据现有数据可知，猪、牛精子的头颈长度比率与人精子类似，但尾部差异相对较大。特别是猪精子曾在多篇关于精子优化方法和精子速率检测的研究文章中被使用，其操作过程基本与人ART技术的一致，且试验结论也具有一定的可推广性[32-34]，因此可作为人精子的替代生物材料进行试验。但是因为是动物来源材料，仍需要对其病原体去除以及对精子获能动力等过程进行验证并与人精子比较，以确认其适用性[35-36]。

除了使用动物精子模型替代人精子这个思路外，进行其他替代试验也是另一个探索方向，比如上文提到的，制动液类产品不适用于精子存活试验时可用鼠胚试验代替[13]。因为精子存活试验和鼠胚试验都能达到验证环境或材料对配子细胞或胚胎是否具有毒性的目的，因此二者被广泛应用于评估IVF-ET实验室及其配套仪器耗材质量，比如说新安装的培养箱就需要以已运行培养箱为对照进行精子存活或鼠胚试验，检验合格后才可以启用[37]。但相较于鼠胚试验，因为精子存活试验具有灵敏性高，操作简便等优点，是IVFET实验室应用最为广泛的质控试验。且鼠胚试验虽进行结果的判定，但无论是采用显微镜同计数板配合进行目视测量还是计算机辅助分析系统（CASA）都只能在同一时间观察单个焦平面上的精子状况，因此对于其整体状况的评估也需要进一步验证的质量[38]。

4 思考与讨论

随着世界范围内人类辅助生殖技术的发展，我国相关技术与标准化体系也有了长足的进步。但不得不承认的是相关标准制修订工作仍存在着大片空白，比如说除人精子存活试验外其他适用于人精子优选类产品或制动类产品的安全性及功能性试验尚无统一标准。特别是此类试验往往需要通过精子活力或精子活动力进行结果的判定，但无论是采用显微镜同计数板配合进行目视测量还是计算机辅助分析系统（CASA）都只能在同一时间观察单个焦平面上的精子状况，因此对于其整体状况的评估也需要进一步验证后进行约定。除此之外，谈及人精子试验就一定无法回避伦理问题，因此进一步探索人精子的替代试验也会是未来人类辅助生殖技术用产品毒性评价的重要方向。