人类辅助生殖培养液的质量控制和安全性评价

【作 者】赵丹妹，黄元礼，王春仁，柯林楠，韩倩倩

中国食品药品检定研究院，北京市，102629

0 引言

人类辅助生殖技术（human assisted reproductive technology，ART）主要是通过人工方式将配子（卵子和精子）在体外结合，形成受精卵后将其移植回母亲子宫。是继药物、手术解决不孕不育问题后又一有效手段。人类辅助生殖技术主要包括体外受精、胚胎培养、胚胎移植三个过程。在此过程中尤其在实验室中，会涉及大量的人类辅助生殖培养液[1]，比如在体外受精阶段有精子显微操作液、取卵-胚胎处理液、配子处理液、卵裂胚培养液、精子制动液；在胚胎培养阶段有生长液、卵裂胚培养液、受精培养液、培养用油；在胚胎移植阶段有胚胎胶、胚胎移植液等；在胚胎冷冻保存阶段有卵裂胚冷冻液、卵裂胚复苏液、囊胚玻璃化冷冻液、囊胚玻璃化复苏液等。这一系列的培养液主要为配子和受精卵提供生存与发育的能量组分。而配子、合子及不同细胞阶段的胚胎，对于微环境的变化十分敏感，不同阶段使用的培养液的质量将直接影响着胚胎及后代的健康，所以，对于辅助生殖培养液的质量和风险控制尤为重要。

胚胎对于能量的利用有着不同发育阶段的特异性。市场上有多种不同配方的培养基可供选择，从简单的盐溶液到含有合成氨基酸和生长因子的复杂组织培养基。一般辅助生殖培养液的组成成分有盐类、碳水化合物、维生素类、重组胰岛素、乙二胺四乙酸（EDTA）、人血清白蛋白、抗生素、醇类、氨基酸类、石蜡油等[2]。而在这些产品中，每种组分的作用与其风险都应予以考虑，因为这些都关系着体外辅助生殖治疗的安全性与有效性。辅助生殖培养液之间的差异能够影响到胚胎的产前及产后发展、囊胚形成率、胚胎着床率、活产率、胎儿出生体重等重要环节[3-4]，需要严格对其进行质量控制。

目前，人类辅助生殖培养液在我国被作为第三类医疗器械进行管理，均需对其中的组分稳定性、降解产物与杂质的风险、添加药物的质量进行控制。

1 人类辅助生殖培养液的成分稳定性控制

人类辅助生殖培养液在正常使用过程中，应确保不会对于配子、胚胎或者准妈妈的安全性产生不利影响。这就需要对于培养液中组分的稳定性进行控制。需要监测其中的关键组分，在产品的有效期内适当的储存条件下，确保其含量在维持产品功能性的要求范围内，且不产生不利影响。对于辅助生殖培养液类产品，在上市前的注册检验过程中，应采用相应的检测手段对于培养液中添加的主要成分如各种维生素、丙酮酸、葡萄糖、EDTA、氨基酸、人血清白蛋白、抗生素等的含量进行确定，确保其成分含量的有效性，进而确保产品质量。

维生素作为维持细胞生长的活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或者辅酶，对于细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素（A、D、E、K）常从血清中得到补充。而水溶性维生素包括维生素B类（生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12）和维生素C。维生素C是不可缺少的，对具有合成胶原能力的细胞更为重要。而引起维生素降解的主要因素包括：培养液pH、氧化、光照（紫外）、加热以及存在有能引起其它化学反应的活性物质。保证各种所需维生素含量的稳定性是维系合子、受精卵、胚胎发育正常的首要条件。如维甲酸（RA）被证明是细胞发育和分化、胚胎生长和生殖功能的重要调节器。RA也可以严格控制许多生殖事件，如卵母细胞发育、卵泡生长和胚胎早期生长。此外，RA还管理细胞的凋亡信号和氧化损伤[5]。再如硫辛酸属于B族维生素中的一类化合物，是细胞利用糖类等能源物质产生能量所需的一种限制性必需营养物质，它还是一种有效的抗氧化剂和重金属螯合剂。硫辛酸在多酶系统中起辅酶作用，可以催化丙酮酸氧化脱羧成乙酸及α-酮戊二酸氧化脱羧成琥珀酸反应中的转酰基作用。有研究结果表明[6]，无论在培养期间施加的氧气浓度如何，添加较高浓度的硫辛酸都会导致胚胎发育受损，而相对较低浓度的硫辛酸则会改善胚胎质量。那么就需要严格控制其含量的稳定性。需要持续研究维生素的不稳定性和反应特性，提高培养液的均一性，进而提高其成分的稳定性。

葡萄糖、丙酮酸、乳酸等成分在辅助生殖培养液中起着重要的作用。体外培养液中葡萄糖或丙酮酸钠的含量过高时，会对卵母细胞的成熟产生抑制作用；而含量过低时，会导致胞质和胞核不同步成熟发育；同时，葡萄糖的浓度会直接影响到所述体外培养液的渗透压[7]。现在普遍认为丙酮酸是胚胎植入前发育的所有培养基中的重要成分[8]。丙酮酸、乳酸等[9]三羧酸主要为受精卵的发育提供能量。体外培养发育到卵裂阶段时，主要由丙酮酸和乳酸为胚胎供能，而后发育到致密化期及以后，主要依赖葡萄糖供给能量，并且葡萄糖可以抑制卵裂阶段胚胎的发育，但对绵羊、猪植入前胚胎研究表明葡萄糖对其体外发育无抑制作用。丙酮酸是哺乳动物胚胎生长发育所必需的物质，葡萄糖可以为胚胎提供能量并以关键底物形式调控生物合成通路。葡萄糖[10]作为几乎所有培养液必含的能源物质，是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，起着重要的作用。而在体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生乳酸。而过量的乳酸对体外培养不利，需要限制培养液中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足，细胞生长抑制。此时则需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑。限定培养液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸等成分的含量，降低或消除不利因素，维持其正常效用来确保培养液的安全性与有效性极为重要。

氨基酸[11]是合成蛋白质的必需原料，也是细胞代谢的关键产物。许多研究表明[12]，单个或多个氨基酸的限制会导致mRNA加工和细胞生长受阻，以及产物的氨基酸序列的改变。谷氨酰胺也是辅助生殖培养液中重要的组成成分。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。谷氨酰胺对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的原料。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，可以降解生成不利于人体的氨。另外，天冬酰胺的存在也会降解产生氨。此时，更需控制这些成分的含量。目前，大多采用比其更稳定的丙氨酰谷氨酰胺作为谷氨酰胺的替代成分。

2 人类辅助生殖培养液组分的降解产物与杂质的风险控制

对于某些不稳定但关键的组分需要追踪其降解规律与趋势，考虑这些成分产生的降解产物对于最终的人类辅助生殖培养液的毒性和性能所产生的影响。培养液引入任何一个新的组分，都会有可能增加培养液产生副反应的可能性，从而增加培养液稳定性风险，因此需要结合每个反应特性来决定是否添加某种新的成分，如络合剂/螯合剂通常会降低培养基组分的生物活性。结构类似物的选择需要考虑转运至胞内后，是否可以恢复其生理活性形式。

氨基酸在溶液中会自发地脱氨[13]，且已经证实培养液只需要培养一段时间就会释放出大量甚至达到有毒性水平的氨。体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。乳酸和氨这两种主要代谢废物的积累都可以影响细胞生长以及培养液质量。所以它们作为代谢产物又需要严密追踪其浓度变化，保证其浓度不会对培养液质量产生影响。

培养液中还常加入一些动物源性物质，如在“合成”透明质酸的生产过程中所用的血清白蛋白、从鸡冠中提取的透明质酸等。为了尽量消除或减少从动物组织中带来的风险的传播，也要对这些组分进行相应的质量控制。

血清白蛋白作为蛋白质的主要来源，支持着胚胎的发育能力。血清白蛋白会带来血液制品相关的某些疾病传播的风险。血清白蛋白也给培养液带来了结合脂肪酸和其他代谢产物，如柠檬酸盐和类固醇[14]。有研究已经证明商用的用于人类辅助生殖技术的培养液的血清白蛋白制剂中含有大量未知蛋白质和过渡金属[15-16]。此外，白蛋白的加工可能导致引入已知的化学物质，如用于稳定白蛋白却已被证明对胚胎发育有害的辛酸[17]。在人类胚胎培养液中，还有研究人员提出作为蛋白质补充物的血清白蛋白可能是可检测到的二（2-乙基己基）邻苯二甲酸盐和单（2-乙基己基）邻苯二甲酸盐以及多溴二苯醚的来源[18-19]。为了控制血清白蛋白所带来的代谢废物及其他未知有害物质，既要控制其含量确保有效性，又要跟踪其有害降解产物的变化来保证安全性。为了降低由此所带来的风险，重组人白蛋白被用作有效替代品，其临床有效性也得以证实[20]。

为了评估辅助生殖培养液的总体风险，还有必要对产品进行临床前测试。除了需要对于这些特殊组分及其降解产物的含量变化趋势进行测试外，还应对其生物相容性进行评估，来确保产品的安全性。

3 人类辅助生殖培养液中添加药物的质量控制

人类辅助生殖培养液中需要根据其功能性加入一些辅助药物，如抗生素等，这些药物的存在也会存在相应的风险。需要对这些成分的质量、安全性和有效性进行验证。

细菌污染可以对胚胎的生长发育造成严重影响。细菌快速生长繁殖，既消耗了培养液中的营养成分，又释放大量对胚胎有毒性的代谢物。大肠杆菌等革兰氏阴性杆菌在繁殖或死亡时还释放内毒素，对胚胎具有细胞毒性作用。而在培养基中加入适当的抗生素如庆大霉素可以有效地抑制细菌生长，保证胚胎正常发育[21]。但抗生素的引入，也可能会存在一定的副作用。氨基糖苷类抗生素在医用领域有着不可替代的作用，但其使用上因毒性和耐药性也受到一定限制。在临床上氨基糖苷类抗生素是浓度依赖型抗菌药物，严格控制其剂量非常重要[22]。而对于辅助生殖培养液更应重视，因为抗生素的存在可能会对胎儿产生风险。需要对培养液中的抗生素进行质量控制，降低其产生的风险。

在培养液中也会根据其用途加入相应的激素和生长因子，这对于维持培养液的功能，保证细胞的生长状态等具有重要的作用。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如适宜的胰岛素含量可以促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。

雌二醇（E2）作为一种类固醇激素，能够促进卵泡等雌性生殖器官发育。促黄体生成素（luteinizing hormone,LH）是一种糖蛋白类促性腺激素，对卵子最后的成熟是必须的。成熟卵子的排出与LH峰的出现相关，培养液中LH的存在加速卵母细胞的成熟，随着LH浓度的增高，这种作用越大，同时卵子老化的速度也越快。因此，高LH浓度组中培养48 h的成熟卵子，其受精能力极显著地低于其他组，也极显著地低于相同培养条件下24 h组，培养液中LH含量对培养较长时间的成熟裸卵的体外受精率有极显著的不利影响[23]，故需严格控制其含量。

胰岛素生长因子[24]（insulin like growth factor，IGF）通过与特异性的靶细胞表面受体IGF-IR结合，能够促进颗粒细胞增殖并维持芳香化酶的功能，从而提高了雌激素的合成，并且促进了卵泡进一步发育；而随着雌激素的增多，卵泡对激素的敏感性增强，最终达到了促使卵泡迅速生长的效果[5]。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）通过自分泌和旁分泌的形式调节早期胚胎的发育。在胚胎培养液中加入适当浓度的EGF改善体外受精-胚胎移植的培养环境，将胚胎培养到更合适的阶段再移入子宫，就可能提高其成功率[25]。

现在国内已经有一系列的人类辅助生殖技术产品的相关标准发布。很多国家监管部门也出台了相关的文件，如中国国家药品监督管理局医疗器械审评中心发布了《人类体外辅助生殖技术用液注册技术审查指导原则》[26]，欧盟发布了《Guidelines for Conformity Assessment ofin VitroFertilisation (IVF) and Assisted Reproduction Technologies (ART) Products》[27]。但目前尚未有质量技术标准对成分含量的指标进行明确要求。对于辅助生殖培养液中其他有效成分以及有害降解产物、有关药物等成分含量检验方法的建立，并建立相关的质量标准迫在眉睫。确保在产品货架期内的安全性和有效性，对辅助生殖培养液进行有效的质量控制，才能进而提高辅助生殖技术的安全性和成功率。