耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药监测及分子耐药机制的研究进展

梁武华，梁敏煜，周海燕，吴耀勋

（1.玉林市妇幼保健院新生儿科，广西 玉林 537000；2.吉林医药学院，吉林 吉林 132000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）为肠杆菌属，是社区和医院获得性感染的常见致病菌，可导致呼吸道、消化道、皮肤、泌尿道、血液等部位感染。根据中国CHINET网2018年监测[1]，该菌在临床分离的肠杆科细菌中，已经超越大肠杆菌成为第一位的致病菌。碳青霉烯类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌感染最有效的药物。但随着抗生素的泛用和滥用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP）菌株不断出现和传播[2-4]，成为全球关注的公共卫生问题。2017年WHO将CRKP列为21世纪最重要的耐药病原菌之一[5]，给感染控制带来巨大挑战。如何加强CRKP的耐药性监测和流行病学研究，探究CRKP产生耐药的分子机制，分析耐药规律和特点，控制多重耐药菌的传播扩散，指导临床合理抗感染治疗，成为目前的研究热点。本文就CRKP耐药监测和分子耐药机制的研究进展做一综述。

1 CRKP耐药监测

1.1 CRKP感染流行现状 2001年Yigit等[6]首先在美国北卡罗莱那州医院发现第一株CRKP，此后CRKP在世界各国陆续被报道[7-9]。2007年Wei等[10]在我国浙江省最早分离出CRKP的菌株。2008年在印度发现对包括碳青霉烯类在内的所有β内酯胺类抗生素耐药的“超级细菌”[11]，引起全球广泛关注。

近年来我国临床分离的肺炎克雷伯菌中CRKP阳性率大幅度增加。王娜等[12]调查某医院6年间CRKP的分布及变迁情况，结果显示，CRKP检出率由2012年的0.4%上升至2017年的29.5%；重症监护病房（ICU）CRKP的分离率明显高于普通病房。吴方强等[13]报道：安徽医科大学第一附属医院从4 830份感染者标本中检出CRKP 690株，占14.29%，2018年CRKP分离率为16.67%，高于2014年的12.98%；中国人民解放军总医院2013年至2017年病原菌分布及药敏分析结果显示[14]，医院共从标本中分离出4 946株KP，其中710株为CRKP，占14.4%，且医院CRKP由2013年的3.2%增至2017年的29.3%。赵建平等[15]对某三甲医院2011年至2018年CRKP的分离情况和耐药现状进行分析，CRKP检出率由2011年的0上升到2018的26.5%，增长趋势明显；2018年全国细菌耐药监测网（CARSS）监测结果显示[16]，2013年，CRKP菌株的检出率为4.9%，2018年已上升至10.1%，各省分布有差异，全国CRKP检出率最高的地区是河南省、上海市及北京市，其中河南省上升幅度最大，较2017年25.9%上升至32.5%。面对CRKP检出率持续增加的严峻形势，临床需引起高度重视，应给予更多的关注，加强对CRKP的动态监测和主动监测。

CRKP引起院内感染暴发流行事件屡有发生，在英国、中东地区、我国山东省等地均曾被报道过[17-19]。NICU是肺炎克雷伯菌感染的高发区，近年来不断出现CRKP在新生儿病房暴发流行[20-21]。贾楠等[22]曾报道5株携带NDM-1基因及其他多重耐药基因的“超级细菌”引起新生儿病房医院感染的聚集暴发。提示由CRKP引起的感染和暴发已成为非常棘手的严重问题，应加强碳青霉烯类抗菌药物应用的管理及医院感染的防控手段，避免耐药细菌的暴发和流行。

1.2 CRKP耐药现状 21世纪初，碳青霉烯类抗生素对肺炎克雷伯菌的敏感性为100%[23]。近年来，随着CRKP的出现，检出率不断上升，耐药率呈持续升高趋势。意大利的一项研究[24]显示，在检出的131株肺炎克雷伯菌菌株中，对至少一种碳青霉烯类具有耐药性的有42株（占32.1%）；Liapis E等[25]对法国21家医院产KPC酶的53棵菌株研究发现：95%的菌株对厄他培南不敏感；在国内，张凡等[26]调查我国2009年至2016年耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的药物敏显示：193株CRKP对9种抗菌药物耐药率均高于65%，其中对亚胺培南从53.3%上升至91.5%，对美罗培南从40.0%上升至90.2%，总耐药率分别为77.2%和80.8%，耐药形势严重。欧阳娜等[27]回顾分析2009年至2018年10年间10 075株KP，结果显示，KP对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈逐年快速上升的趋势，对亚胺培南的耐药率从0.6%上升至34.3%；对美罗培南的耐药率从1.5%上升至32.7%。2018年欧洲抗菌素耐药性监测网（EARS-Net）最新数据提示[28]：2018年肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药性为26.6%，对美罗培南的耐药性为17.6%。2018年中国CHINET网的细菌耐药监测结果显示[1]，肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2005年的3.0%和2.9%上升至2018年的25.0%和26.3%，耐药率上升幅度高达8倍多。值得关注的是，5所儿童医院（含妇幼保健院）中除1所医院分离的肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率为2.5%外，其余4所的耐药率范围为32.1%～45.5%，提示免疫功能低下者为CRKP的易感人群。英国曾经发出警示，需洞察CRKP对碳青霉烯类抗生素耐药性的“威胁”[29]。因此，面对KP对碳青霉烯类的耐药率明显上升趋势，需引起临床的高度重视，加强CRKP的耐药性监测，获得常见临床分离菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率，采取积极有效措施，控制耐药细菌在全国范围内的传播。

2 分子基因耐药机制

在细菌耐药性监测的基础上，开展适当的耐药基因检测和分子分型，可揭示耐药菌的耐药机制和传播规律，为防治和控制耐药菌传播提供临床依据。CRKP耐药性与其产生及携带不同的耐药基因密切相关。主要包括：①产碳青霉烯酶；②高产AmPC酶或超广谱β内酰胺酶（ESBLS）合并外膜的丢失；③膜孔蛋白基因缺失或表达下调；④外排泵基因高表达；⑤PBPS蛋白缺失或亲和力下降等。上述耐药基因可单独或共同作用，从而降低碳青霉烯类抗生素耐药或敏感性。

2.1 碳青霉烯酶 碳青霉烯酶是一类β-内酰胺酶，能水解包括碳青霉烯类药物在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素。按照Ambler分子分类，可进一步分别为A，B，D 3类。

2.1.1 A类酶 A类酶包括GES、KPC、SME、SHV-38、SCF-1等，其中产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）型最常见。KPC由质粒介导，凭借可移动元件，向不同菌株、菌种间迅速扩散，造成院内感染，并在不同地区间传播、流行。目前发现KPC有19种基因型，其分布呈显著地域特点。国外主要以KPC-3型为主，我国以KPC-2型多见。高倩倩[30]收集上海两所教学医院84株CRKP菌株分析常见耐药基因，其中bla-KPC-2阳性率为90.5%，克隆分型中ST-11型占71株（84.5%），提示CRKP耐药主要与bla-KPC-2有关。ST-11为CRKP的主要克隆分型，呈克隆传播趋势。黄亚雨等[31]分析33株CRKP菌株，携带KPC基因32株，携带SHV基因30株，携带NDM-1基因1株；同源性分析显示，ST-11/A型29株，ST-15/B型2株，提示CRKP耐药与携带KPC耐药基因有关，与SHV共同作用并致耐药。大部分CRKP为ST-11型，同源性程度高，易在医院内克隆性传播。

2.1.2 B类酶 B类酶为金属β-内酰胺酶，包括IMP，VIM，GIM，SIM，NDM（新德里金属酶）等。其中最主要的为NDM，2008年首先在一位印度裔尿路感染患者中分离出并命名为NDM-1[32]，至今已发现NDM-1的15种蛋白位点突变体。在我国NDM-1不断有报道并呈上升趋势[33-35]，近年来在国内外逐渐有产NDM-5肠杆菌科细菌的报道[36-38]。该类型NDM基因有共同的特点，即有独特的基因序列，其基因元件位于质粒上，易在不同菌株间转移、传播，引起广泛耐药，产生广泛耐药与质粒水平传播密切相关。携带NDM基因的KP除黏霉素外，对所有抗生素耐药，被冠以“超级细菌”，大大增加CRKP感染的治疗难度，已成为人类公共健康的主要威胁，成为临床抗感染治疗的主要挑战。

2.1.3 D类酶 D类酶又称苯唑西林酶（OXA酶）。在肺炎克雷伯菌中检出最多的是OXA-48，有11种OXA-48型碳青霉烯酶的变体。Poirel等[39]最早在一个土耳其患者中发现，后迅速在美国、印度、中国等国家流行[40]。OXA-48型主要由质粒编码，可在不同菌属的肠杆菌科细菌中传播；携带该基因的肺炎克雷伯菌，可同时产生KPC，ESBLS酶等，表现出对碳青霉烯类的强水解活性；当合并膜孔蛋白缺失或OmpK35和Omp K36的变异时，导致对碳青霉烯类抗生素高水平耐药[41]。其他类型OXA酶也与CRKP耐药有关。

2.2 AmpC酶 AmpC酶又称头孢菌素酶，有40多种基因型，国外以CMY-2型多见，我国多见类型为DHA-1型和ACT-1型[42]。Shi等[43]发现，DHA-1型伴随膜孔蛋白（Ompk36）变异，可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药。AmpC酶以质粒作为载体，通过接合，转化，转导等方式，导入肺炎克雷伯菌体内缺乏的AmpC基因，促使该菌产生AmpC酶，并使耐药基因在不同菌株间转移。质粒介导的AmpC酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的主要原因。

2.3 膜孔蛋白基因缺失或表达下调 膜孔蛋白是肺炎克雷伯菌细胞外膜上一种特殊的水溶性通道蛋白，由OmpK35、OmpK36、OmpK37基因编码，其中起关键作用的是OmpK35、OmpK36。膜孔蛋白是物质交换的通道，碳青霉烯类抗生素通过膜孔蛋白进入菌体内，杀灭细菌，从而发挥抗菌作用[44]。当膜孔蛋白缺失或表达下调时，抗菌药物无法进入菌体内，从而产生耐药。以往研究[45]发现，当膜孔蛋白缺失同时合并产ESBls或AmpC酶时，才表达对碳烯类抗生素高水平耐药。而罗洪英等[46]在分析70株CRKP菌株中发现：产KPC酶同时Ompk35表达下调占50.77%，缺失占9.23%；OmpK36表达下调占3.08%，缺失占55.3%；说明产KPC酶同时合并膜孔蛋白的表达降低或缺失，与细菌耐药性密切相关。而最新的研究[47]发现：质粒介导的NDM-1酶合并OmpK36表达降低或缺失，是导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药的主要原因。

2.4 外排泵基因高表达 外排泵在肺炎克雷伯菌中广泛分布，普遍存在。AcrAB-TolC外排系统是肺炎克雷伯菌最主要的外排泵，存在于细菌内膜。研究[48]发现，外排泵基因被底物诱导激活后，呈高表达状态，将进入细菌中的抗菌药物主动排出体外，导致肺炎克雷伯菌产生耐药性，甚至多重耐药性。国内zhuo等[49]首次从多重耐药肺炎克雷伯菌中检出mdf-A，Smr，tehA等外排泵结构基因，证实AcrAB-TolC外排系统高表达会导致KP的多重耐药。OqxAB外排泵系统是近年来在KP中发现的一种较新的外排泵，由OqxA和OqxB共同编码，共同存在，其中OqxB起主要作用[50]，其主要通过促进细菌生物膜形成，介导肺炎克雷伯菌产生耐药。Filgona等研究[51]发现：应用外排泵抑制剂后，CRKP对厄他培南、多尼培南的MIC值明显降低，表明外排泵基因和其他耐药机制共同存在，参与耐药。

2.5 PBPS蛋白缺失或亲和力下降 PBPS即青霉素结合蛋白，其位于细菌内膜，是能与β-内酰胺类抗生素共价结合的一类酶。β-内酰胺类抗生素与PBPS结合后，干扰酶的正常功能，引起细菌自溶或形成球状体、丝状体，最终细菌分裂而发挥杀菌作用[52]。不同种类细菌所含PBPS不尽相同，但结构和功能却很相似。研究[53]证实，PBPS的结构变异，数量改变或与抗生素亲和力下降，是导致KP对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。还有研究[54]表明，PBPS通过靶位点改变，使进入菌体内抗生素不能与PBPS位点结合，因而不能发挥杀菌作用而耐药。而最新的研究[55]显示，多个PBPS联合变异，可导致KP高水平耐药。因此，PBPS蛋白缺失或亲和力下降，对细菌耐药性的产生起至关重要的作用。

3 小结与展望

肺炎克雷伯菌作为一种条件致病菌，是导致院内感染和社区获得性感染的主要细菌。碳青霉烯类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌感染的“中流砥柱”。但在强大的抗生素应用压力下，随着临床应用不断增加和滥用，CRKP检出率不断增加，CRKP感染逐年攀升，多重耐药日益严重。CRKP耐药性与其产生不同的耐药基因，并通过质粒传导密切相关，遏制CRKP的进一步流行传播迫在眉睫。展望未来，积极开展CRKP菌株的主动监测，及时获得分离菌对各种抗生素的耐药率，指导临床合理治疗。在此基础上，开展分子水平的耐药基因检测，揭示CRKP的分子耐药机制和传播规律，掌握本地菌株的流行趋势和耐药特点，有针对性的制定合理有效的预防控制措施，将有助于有效防止肺炎克雷伯菌多重耐药的产生和蔓延。