上调A20表达对阿尔茨海默病小鼠海马组织神经元的保护作用*

孙丽慧 张萌 郎尉雅 王月静 张海燕 冯化杰

齐齐哈尔医学院,黑龙江 齐齐哈尔 161001

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，它可引起中枢神经系统损伤和变性，随着年龄的增长该病呈持续性的发展，目前全世界患病人数已达3000万人以上，阿尔茨海默病患者临床表现为学习记忆力显著下降，严重的患者不认识自己的家人、朋友，导致其不能与人正常交流，很难照顾自己的生活起居，给患者的家属增添了经济负担和精神负担。这使患者家属的心理压力不断增加，给患者和家属带来痛苦，因此寻求有效的治疗方法迫在眉睫，有研究发现ZBTB20缺陷导致了海马发育的严重障碍，推测ZBTB20是调控海马CA1神经元的细胞命运和海马发育的关键分子。近年学者发现，锌指蛋白在老年痴呆小鼠模型中有一定影响，但可能机制尚不清楚。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育方面具有重要的作用。近年来已成功设计了特异性锌指蛋白元件用于调节与疾病相关基因的表达，为临床基因治疗疾病提供了广阔的前景。本研究构建了锌指蛋白A20基因重组腺病毒，进一步研究上调锌指蛋白A20表达是否修复阿尔茨海默病模型小鼠神经细胞的损伤，为改善和修复受损的海马神经元提供依据。

1 材料和方法

1.1主要试剂及实验动物 腺病毒载体A20 购自上海吉凯公司，健康12w龄雄性 AD 小鼠，体质量25-30 g，购自南京大学实验动物中心[可证号 IACUC-DB-16-0602]。动物在适应环境 1周后开始实验。实验均在标准清洁级动物实验室内完成。实验前禁食 12 h，自由饮水。

1.2实验方法 将 30只小鼠随机分3组：对照组，AD组，A20-AD组(海马内注射高表达A20慢病毒)，麻醉后用脑立体定位仪定位在海马位置并固定，A20注入海马内，将携带高表达A20慢病毒注射海马内1min内推完。

1.3甲苯胺蓝染色法检测海马组织神经元变化 取材后取海马组织，将组织制成蜡块，用石蜡切片机切片、脱蜡、水化，染色后脱水，封片: 中性树胶; 观察海马神经元变化。

2 结 果

甲苯胺蓝染色法检测海马组织神经元变化，结果发现，与AD组比较，A20-AD组海马神经元形态发生改变，损伤的神经元被修复，神经元形态变得规则饱满，损伤神经元数量减少，提示上调A20表达可修复阿尔茨海默病损伤的海马神经元。

3 讨 论

阿尔茨海默病患者主要临床表现为认知障碍及精神行为异常，患者的生活质量显著下降,由于患者学习记忆力能力减退[1-2]，导致患者可能走失的概率增加，患者判断力、语言能力减退及视空间障碍，这些症状可导致患者跌倒及发生意外，随着病情逐渐加重，患者会出现精神障碍，如：焦虑、抑郁、睡眠障碍等[5-9]，阿尔茨海默病的主要病理特征为β-淀粉样蛋白(amyloid-beta，Aβ)沉积于脑内形成老年斑(senile plaques，SP)，以及大量神经纤维缠结并伴随着神经元减少以及轴索和突触异常、颗粒空泡变性等。现代医学对AD的研究虽然已进入到基因、分子水平，但其病因迄今不明[10-11]。一般认为AD是复杂的异质性疾病，多种因素(遗传因素、神经递质、免疫因素、环境因素等)可能参与致病。现普遍认同的发病机制一般有: Aβ学说，Tau 蛋白学说，载脂蛋白E基因，中枢胆碱能损伤，兴奋性氨基酸毒性学说，胰岛素信号传导途径，胆固醇代谢异常等。患者严重时需要照顾全部的日常生活，这给家属带来沉重的精神及经济负担，这种疾病无特效药物，因此，寻求有效的治疗药物至关重要，本研究构建了锌指蛋白A20基因慢病毒，进一步研究上调锌指蛋白A20表达是否修复阿尔茨海默病模型小鼠神经细胞的损伤，锌指蛋白A20的特点是什么呢？

A20最初作为人脐静脉内皮细胞中的TNF。诱导基因被发现，因此也被称为TNFa诱导蛋白3( TNFAIP3)，A20蛋白的结构域中包含N末端(1-385)和C末端(386-775)，其中N末端区具有一定的特征性，称为特征性结构区，该区域与已知的蛋白质结构都无同源性;另一端又称C末端的结构域为锌指区，因此，A20又称锌指蛋白，A20是抑制多种细胞内信号通路的重要的抗炎分子，在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞中，发现A20上调，而A20与白介素受体1相关激酶(IRAK 1)的相互作用是内毒素耐受的决定因素，在肠上皮细胞中，A20也具有诱导LPS耐受的功能。A20不仅具有重要的免疫调节作用，也是有效的肿瘤抑制因子，A20通过调节NF-KB信号通路的转导来发挥作用，锌指蛋白A20可以连接到多种功能蛋白(如ABINs、LMP1、14-3-3等)，A20的锌指区连接到这些功能蛋白后可发挥对机体的保护作用[4]，有研究发现锌指蛋白在神经细胞中能抑制细胞凋亡、坏死及炎性反应等过程，前辈研究发现锌指蛋白A20在正常毛细胞中沉默表达，受到损伤后毛细胞会出现锌指蛋白A20的短暂表达，由于低量和短时间表达A20很难对毛细胞起到保护作用，上调A20的表达可对损伤细胞起到保护作用，这与我们的研究结果相似的，我们的研究结果发现，上调A20的表达可修复损伤的海马神经元细胞，因此，我们初步探究作用，然而，它的具体作用机制还需要我们继续研究。