神经生长因子与类风湿关节炎免疫病理的研究进展

杨春蕊 董化江 周新富

1天津医科大学第二医院病理科300200；2天津大学医学工程与转化医学研究院300072；3中国人民武装警察部队后勤学院，天津300189；4澳大利亚南澳大学药理学和医学科学院，阿德莱德5000

0 引 言

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，其特征是进行性、侵袭性关节破坏，可导致严重的功能恶化，且死亡率较高。RA 患者多表现为关节外症状，包括类风湿结节，还有免疫系统功能紊乱，可并发心、肺、肾、神经和血管等多个系统的疾病[1-2]。RA 基本病理改变为关节内增生滑膜炎和关节外血管炎，血管翳形成促进受累关节软骨和骨质破坏，最终诱发关节畸形和功能障碍。RA 还与心血管疾病、抑郁症和社会心理压力密切相关[3]。据研究显示，发达国家的RA 发病率约为0.5%～1%，任何年龄段均可患病，临床上女性比男性患病率高，并且遗传率约为60%[4]。有研究发现，RA 的发生发展机理是诸多淋巴细胞异常作用的结果，其中RA 疾病发生发展的关键因素是炎症反应与B 细胞、T 细胞亚群的失衡[5]。相关研究结果表明，RA 中活化的巨噬细胞浸润关节，并分泌多种炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白 介 素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[6-7]。神经生长因子（nerve growth factors，NGF）属于神经营养因子，NGF从巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞中释放出来，介导慢性疼痛症状，并在介导炎症中起重要作用[8]。最近的研究结果表明，NGF 在组织疼痛、介导炎症反应、使周围神经敏感和人体免疫中同样起重要作用，并逐渐被研究者所认识。本文中，就NGF 的生物特性、生理作用、与RA 的相关性、免疫病理特点及相关最新研究进展进行综述。

1 NGF 概述

1.1 NGF 生物学特性

NGF 属于神经生长因子家族中最主要的一类，对神经具有营养作用，是对神经元轴突和突触生长、存活至关重要的蛋白之一。NGF 于1952年由意大利神经生物科学家Rita Levi-Montalcini 在研究鸡胚背根节的神经生长和发育过程中发现[9]。神经营养因子家族包括NGF、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-4/5 等[10]。NGF是神经营养因子家族中最早被发现，也是目前研究最深入的神经营养因子，其对神经元的生长发育及加速神经系统损伤的修复具有至关重要的作用和临床意义[11]。NGF 的相对分子质量为14000，是1 号染色体上的一个基因编码产生的一种具有高度同源性的保守蛋白分子。其由2 个α 亚基、1 个β 亚基、2 个γ 亚基以非共价健结合构成，其中α 亚基不具有活性，β 亚基具有生物活性的功能，γ 亚基具有独特的蛋白酶活性，可能与神经生长因子前体（包括proNGF 和proBDNF 等）向成熟神经生长因子转化有关[12]。NGF 来源十分广泛，可以由不同来源的细胞合成分泌，大部分来源为由神经元、神经所支配的效应器细胞和胶质细胞。NGF 主要分布于脑、神经节、心脏、脾脏、平滑肌和胎盘等组织，以及一些腺体（如唾液腺、前列腺等）[13]。近年来研究者发现，NGF 还能够从肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和角化细胞中释放[8]。所以，NGF 作用的主要靶标不仅包括中枢和周围神经系统的神经元，还包括不同器官、免疫细胞和组织细胞。

1.2 NGF 的受体及生理作用

NGF 通过与酪氨酸激酶（tyrosinekinase，TrkA）或神经生长因子受体p75 （p75 neurotrophin receptor，p75NTR）相结合发挥生物学功能。TrkA 是高亲和力受体，是公认的NGF 的功能性受体，与NGF 结合后形成复合体并内化进入胞内，诱导TrkA发生自身磷酸化，使胞内区的TrkA 活性增高，通过激活胞内一系列的信号通路包括PLC/PKC、MAPK、ERK、PI3K/Akt 和PLC-γ 等，从而可以通过促进基因转录或者离子通道蛋白表达来诱导细胞存活，抑制细胞凋亡、增殖和分化等后续效应，以及参与疼痛的产生及维持[14]。而p75 是低亲和力受体，是一种跨膜蛋白，通过提高TrkA 的磷酸化作用调节信号通路。研究者发现在p75 存在情况下，能够增强TrkA 磷酸化程度达8 倍[15]。也有研究者发现，NGF与p75NTR 结合可以激活转录因子κB（NK-κB）通路和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）/抑癌基因p53 通路，诱导细胞凋亡，发挥生物学作用（如产生疼痛和痛觉敏感），并引起神经元的萌芽和生长分化[15-16]。

NGF 的生理作用包括以下几方面。第一，神经再生作用，NGF 具有神经元营养和促突起生长双重作用[17]。第二，保护受损神经元；NGF 可减少受损神经纤维的死亡和调控受损神经元的基因表达，促进神经纤维生长、分化和创伤损伤修复，维持机体稳态[18]。第三，介导炎症反应中发挥作用；NGF 对炎症反应具有双向调节作用，在退行性疾病中抑制炎症反应，促进神经修复，维持大脑功能，而且在炎症性疼痛中促进炎症反应趋化作用和刺激再生神经的血管生成[19]。第四，调节免疫细胞功能；NGF 对存在的固有免疫发挥作用, 其通过促进髓样前体细胞生长和成熟来调节免疫细胞以及作为神经免疫信号在脾脏和胸腺中发挥作用[20]。第五，介导慢性疼痛的疼痛症状；在损伤、炎症或关节持续的炎性疼痛过程中，机体NGF 水平升高，疼痛感受器变得敏感，通过选择性阻断NGF 受体TrkA 可起到缓解与治疗疼痛的作用[21]。因此，NGF 的生理学作用中的促进神经生长、炎症、血管生成、免疫反应和疼痛都是相互关联的过程。

1.3 NGF 前体蛋白

神经生长因子前体蛋白（proNGF）是NGF 的前体形式，是一种重要的凋亡因子，其广泛分布于神经系统以及周围非神经系统的组织及细胞中。proNGF 不仅作为NGF 的前体形式存在，并由基质金属蛋白酶裂解为成熟NGF。越来越多的研究结果表明，proNGF 具有独立于NGF 以外的生物学作用，其可与p75NTR 高亲和力结合，诱导细胞凋亡，其能力明显强于NGF[22]。proNGF 与p75NTR 的结合能力明显高于proNGF 与TrkA 的结合力，它能和p75NTR 及跨膜蛋白sortilin 结合形成proNGF-p75NTR-sortilin复合体，通过JNK 信号传导通路激活之后发挥促凋亡作用及炎症反应。其中，sortilin 在proNGF 发挥促细胞凋亡过程必不可少，sortilin 在控制细胞凋亡过程中发挥了“分子开关作用”，诱导p75NTR 发挥关键作用[23]。研究者发现proNGF 和proBDNF 等可以促进细胞凋亡及炎症反应，对自身免疫病有调节作用[24]。此外，proNGF 在体内除用于产生成熟NGF外，其本身具有独特生物活性的独立蛋白分子，也在神经和非神经系统中发挥重要的生理功能[25]。

2 RA 免疫病理机制、RA 免疫治疗与NGF 相关性

RA 是一种以慢性炎症、系统性、进行性骨损伤为特征的自身免疫性疾病，病理特征以T 淋巴细胞浸润引起的滑膜炎症及单核细胞介导的骨质破坏为主。目前，越来越多的研究者关注免疫炎症介导的疼痛行为，许多证据表明NGF 参与慢性关节炎疼痛的过程，并且NGF 的表达与RA 激活的炎症相关。NGF/TrkA 信号通路通过增加神经元释放P 物质和降血钙素基因相关肽，参与RA 的神经源性炎症的病理生理过程[26-27]。目前，尽管RA 自身免疫损伤的病理机理尚未阐明，但众多证据表明NGF 及其传导通路在介导炎症反应与疼痛行为中发挥重要功能，与RA 可能密切相关。

2.1 NGF 水平与RA 免疫病理相关性

尽管NGF 在RA 中的相关免疫病理机制不十分明确，但可以肯定的是阻断NGF 对关节炎疼痛有效[9]。Minnone 等[26]通过RT-PCR 检测发现NGF mRNA在RA 患者滑膜液和滑膜组织中的表达比在骨性关节炎患者中显著升高，其表达升高可能是关节疼痛与功能障碍的原因；流式细胞检测结果表明，NGF蛋白在RA 患者滑膜液中CD3+T 细胞和CD14+细胞（即单核细胞/巨噬细胞）均有表达。此外，滑膜组织来源的成纤维样滑膜细胞在体外不能产生NGF[27]。Raychaudhuri 等[28-29]通过酶联免疫吸附测定法发现RA患者滑膜液中NGF 水平比骨性关节炎（osteoarthritis,OA）患者的骨膜液中的水平高，NGF 通过TrkA 诱导的成纤维滑膜细胞增殖明显，还发现RA 患者关节的成纤维滑膜细胞自发产生更高水平的NGF；其结果表明NGF 的生产失调可能会影响RA 的炎症和增殖级联反应。NGF 可能直接作用于免疫细胞，并且是B 细胞、嗜酸性粒细胞和滑膜成纤维细胞的一种活化/激活因子[30]。NGF 已被确认为是促血管生成因子，影响血管生成和细胞运输，可能是慢性炎症性关节炎（如脊柱关节炎和RA）的另一重要致病途径[31-32]。RA 患者关节血管翳组织黏附在关节软骨上，这表明增殖的成纤维滑膜细胞产生蛋白酶会降解软骨和下层皮质骨[33]。Ashraf 等[8]的基础研究结果表明，通过胶原诱导的关节炎模型SD 大鼠出现疼痛行为与滑膜炎症改变，采用TrkA 阻断剂AR786 全身给药治疗后疼痛行为减少，并抑制了关节肿胀、滑膜炎症和关节损伤的组织学改变。

综上，NGF 发挥对免疫细胞激活和促血管生成作用，该结论为关节炎的神经生长因子假说和潜在治疗RA 的生物制剂靶点提供了研究基础。

2.2 NGF 受体TrkA 在RA 免疫病理及其治疗中的变化

TrkA 是公认的NGF 高亲和力受体，NGF 与靶标组织受体结合后，诱导TrkA 自身磷酸化，NGF 与TrkA 受体结合促进基因转录来诱导细胞存活，抑制细胞凋亡、增殖和分化等后续效应。Raychaudhuri等[34]发现从半月板损伤患者（无其他关节疾病）穿刺取得的成纤维样滑膜细胞低水平表达NGF/TrkA，然而在TNF-α 和IL-1 刺激后，成纤维样滑膜细胞中NGF和TrkA 表达明显上调；此外，还发现与OA 患者相比，来自RA 患者的成纤维样滑膜细胞自发产生高水平的NGF，并增加TrkA 的表达。在该研究中，通过四唑盐比色法，发现NGF 对成纤维样滑膜细胞具有明显的促有丝分裂作用，NGF 的中和抗体能够阻断它的作用，进一步证实NGF 具有诱导成纤维样滑膜细胞增殖的作用[34]。TNF-α 是RA 病理生理过程中重要的致炎因子，介导滑膜炎和骨软骨交界破坏，并且发现促炎细胞因子在成纤维样滑膜细胞中上调NGF/TrkA[35]。目前，治疗RA 的生物制剂中，已上市的TNF-α 拮抗剂有4 种。因此，RA 治疗影响NGF水平的可能机制包括：通过特异性的与TNF-α 结合，竞争性阻断TNF-α 与细胞表面的受体相结合，抑制由TNF-α 受体介导的异常免疫反应及炎症过程，降低NGF 的表达；可通过下调TrkA，在动物模型中选择性阻断TrkA，干扰NGF/TrkA 途径，降低NGF 的表达，抑制NGF 活性，缓解疼痛，减少骨关节炎的结构性损伤。

2.3 proNGF 受体p75NTR 在RA 免疫病理及其治疗中的变化

proNGF 作为NGF 的非活性前体，其生理作用不同于或甚至与NGF 相反。值得注意的是，体内研究结果表明proNGF 在脑组织和外周组织中的分布比NGF 更加丰富[36-37]。p75NTR 是proNGF 的高亲和力受体，但鲜有关于proNGF 与p75NTR 的结合在调节免疫应答中作用的研究。研究结果证实了proNGF-p75NTR 轴在慢性关节炎中的潜在作用，以及proNGF 通过p75NTR 受体对RA 炎症关节内单核细胞的作用[26]。研究结果表明，RA 患者滑膜成纤维细胞内proNGF 水平升高，而且proNGF/NGF 比率在RA 患者滑膜液中显著增加，与NGF 相反，proNGF给药增加了炎性细胞因子，从而诱导了p38 和JNK 通路的更强活化，可能通过中和抗体或抑制p75NTR 的作用对RA 治疗具有一定潜在作用。因此，使用p75NTR 抑制剂激活proNGF-p75NTR 轴促进促炎机制，调节炎症组织炎症反应，可能代表了治疗慢性关节炎的一种新的方法。

2.4 NGF、anti-NGF 抗体（Tanezumab）与疼痛在RA中研究

NGF 是人体在出现受伤或炎症反应后，产生的一种重要的致痛物质，在持续的炎症性疼痛中起关键作用，其通过与TrkA 和p75 结合可诱导疼痛信号分子的产生，如SubP、CGRP、BDNF 等[38]。动物研究结果表明，向大鼠膝关节注射NGF 会引起疼痛行为和滑膜炎症，通过静脉注射抗NGF 抗体或TrkA 抗体来抑制NGF 的活性可减少慢性疼痛行为[39]。NGF抗体的研发之路颇为曲折，辉瑞和礼来公司合作开发的中和人源化NGF 单克隆抗体（Tanezumab），是首款通过美国食品和药品监督管理局快速通道获得上市资格的NGF 抑制剂。Tanezumab 可以选择性拮抗NGF 和TrkA 的结合，能够阻断关节、肌肉、皮肤或器官产生的疼痛信号传导到脊髓和大脑，即降低疼痛感觉信号向中枢的传导，从而达到止痛的效果[40]。Tanezumab 与阿片类止痛药的作用机制不同，尚未显示滥用、成瘾性和依赖性的风险[41]。Tanezumab的安全性和有效性在后期大量的临床研究中得到进一步验证[42-43]，其中Ⅲ期临床试验中发现，与安慰剂和非甾体抗炎类药物相比，Tanezumab 可显著缓解骨性关节痛、神经病理性疼痛等慢性疼痛，且无非甾体抗炎类药物的不良反应[44]。在癌性骨痛领域的研究结果表明，Tanezumab 联合吗啡使用时，未发现对认知功能等神经系统功能的影响，可在发挥吗啡镇痛作用之外产生持续的镇痛作用，同时不增加吗啡的副作用[41]。目前，Tanezumab 在RA 进行性炎症性疼痛治疗中应用的报道较少，尚需要更多基础和临床研究进一步观察研究及评价。

综上，抑制NGF 信号传导可能对患有炎性关节炎疼痛的患者有益。

3 结 语

Nwosu 等[39]在两种不同的膝关节疼痛、免疫病理和炎症模型中证明，采用NGF 受体TrkA 阻断剂能够缓解疼痛，控制炎症，恢复功能等。Luo 等[45]发现proBDNF 在介导炎症与疼痛中也发挥重要作用。这些都是近年来研究RA 的最新研究进展，为进一步了解RA 提供了新的证据。但迄今为止，对于NGF在RA 中的相关研究仍处于机理研究阶段，很多机制还未完全明确。由于靶向NGF/TrkA 信号通路在诱导细胞增殖、缓解疼痛和促进功能恢复等多方面有着重要作用，故对NGF/TrkA 进行研究具有巨大的潜在应用价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突