Piezo机械敏感性离子通道在骨关节组织中的研究进展

张超 王平 刘爱峰 张君涛 李远栋

天津中医药大学第一附属医院骨伤科300380

0 引 言

机械敏感性离子通道（mechanosensitiveion ion channels，MSCs）是活细胞表面的机械刺激转化为细胞内电信号或化学信号时主要的机械感受器，并与细胞骨架一起构成机械感受器体系[1-3]。力学传导是细胞接受和转化力学刺激为生物信号的过程，对器官发育和大量生理活动有重要意义[4]。近年来，在真核生物中，Piezo 蛋白作为机械激活阳离子通道逐渐成为研究热点。而骨关节是与力学直接相关的组织，机械力传导及引起细胞内效应对骨科疾病的治疗和预防非常重要，基于此，本文就有关Piezo 机械敏感性离子通道在骨与关节领域的研究进行综述。

1 Piezo 机械敏感性离子通道的发现

2010 年，Coste 等[5]在斯克里普斯研究所发现了两种无特殊功能的老鼠蛋白，这种蛋白表现出机械传感器的特性，他们将这两种具有高度相似序列的蛋白质命名为Piezo1 和Piezo2（“Piezo”在希腊语表示压力或挤压）。Piezo 蛋白是离子通道的成孔状亚基单位，其在力学刺激下开放，可使带正电的阳离子包括Ca2+流入细胞内[6]。当受到力学激活时，这两种蛋白都可独立地诱导阳离子非选择性电流。在不同的物种中，Piezo 都是非常大的蛋白质（人类Piezo1 和Piezo2分别为2521 和2752 个氨基酸），每个蛋白有多个亚基的预测跨膜结构域，与已知的其他蛋白质没有明显的同源性。已经证实Piezo 同源蛋白存在于许多真核生物中，大多数脊椎动物都有Piezo1 和Piezo2 两种通道亚型[5,7]。Piezo1 和Piezo2在人体的不同器官和组织中表达，如大脑、视神经、牙周韧带、背根神经节和皮肤、肺、心血管系统和红细胞、肠胃系统平滑肌、骨组织及关节软骨等。对比两种类型的压电通道，结果表明[8]，Piezo2 具有较快的动力学，通常介导快速的膜反应，而Piezo1 通道的特征是较慢的动力学。因此Piezo2 更适合于检测瞬态机械力，而Piezo1 可对更持久的机械力作出反应。

2 Piezo 蛋白离子通道的结构与功能

虽然Piezo 蛋白通道的整体结构和门控机制仍未知，但GeJ 等[9]通过低温电子显微镜研究发现，小鼠的Piezo1 蛋白是一个三聚体螺旋桨样结构，胞外结构域类似三个远端叶片和一个中央帽，每个亚单位的跨膜区域有14 个节段，中心孔包围一个潜在的离子导电孔，这种三聚体结构使Piezo1 可利用其外围区域作为力传感器为中心的离子导电孔提供通道。这种类似于机械原理的结构使其将力学信号转变为化学信号成为可能。与Piezo1 蛋白结构类似，Wang 等[10]通过低温电子显微镜结构发现，Piezo2也是一个三聚体螺旋桨样机构，包括114 个跨膜螺旋，跨膜螺旋1-36 叠成9 个串联单元，每个单元由4 个跨膜螺旋组成，形成非平面叶片。三个叶片共同弯曲成一个直径为28 nm、深度为10 nm 的穹隆，细胞外帽状结构嵌入在中心，中心孔与细胞内9 nm 长的光束相连。

Piezo1 和Piezo2 两种机械门控离子通道参与了生命所必需的各种生理功能，Piezo1 在小鼠血管系统和淋巴系统的发育中起着重要作用，Piezo2 在感知触觉、疼痛、呼吸和血压方面起着关键作用[11-13]。Piezo 离子通道主要功能为感知并传导机械应力包括细胞刺激、膜扩张、基底偏转或流体流动等。Moroni 等[14]研究表明，除了感知机械力学刺激，Piezo蛋白通道也受电压变化的调控，甚至可切换到纯电压门控模式。他们认为压电通道的电压敏感性是一种深层特性，在不同的细胞环境中增加了压电激活的调节机制。

3 Piezo 蛋白离子通道的抑制剂与激动剂

通常情况下，离子通道都会有其激动剂和抑制剂，Piezo 离子通道也不例外。革兰氏机械毒素4（Grams mechanotoxin4,GsMTx4）是一种抑制非选择性阳离子机械敏感性离子通道的抑制剂，Piezo 通道的发现也开启了GsMTx4 研究的一个新时代，因为Piezo1 在不同的细胞类型之间表达，并被GsMTx4 特异性阻断抑制[15]。Lee 等[16]的研究结果揭示了Piezo1和Piezo2 在软骨细胞的力学环境中是高表达的，同时使用Piezo 通道抑制剂GsMTx4 作用后可降低软骨细胞的凋亡率。Evans 等[17]研究发现，Yoda1 能激活Piezo1 通道的开放，但对Piezo2 通道却没有激动效应。Roh 等[18]研究表明，Piezo1 mRNA 和蛋白在小鼠和人背根神节（dorsal root god，DRG）神经元中有表达，而且Yoda1 通过促进钙内流激活Piezo1 蛋白。他们通过采用腺病毒血清型2/5 介导的shRNA 转染小鼠DRG 神经元，发现转染下调了piezo1 mRNA表达，在相同的DRG 神经元中，Piezo1 也具有瞬态受体电位香草样1（TRPV1）的生理功能，并受小鼠DRG 感觉神经元TRPV1 的激活调节。由此可知GsMTx4 和Yoda1分别是Piezo1 通道的抑制剂和激动剂。

4 Piezo 蛋白离子通道在骨组织中的研究

骨骼系统是一个不断适应力学刺激的动态组织。骨细胞虽然被基质包埋，但所有骨细胞都会暴露并受到宏观和微观力学环境的影响，这些因素会潜在地影响其活性和功能。Piezo 通道是压电家族的机械激活离子通道之一，近年来有报道称，它在成骨细胞和骨细胞中起着力学传感器的作用。Hendrickx 等[19]通过在成骨细胞（Runx2Cre）或破骨细胞（Lyz2Cre）中靶向敲除Piezo1 或Piezo2 基因，发现在Piezo1 缺失的成骨细胞中的小鼠存在严重骨质疏松和大量自发性骨折。这种表型发生在出生后的早期，主要影响继发性海绵状体的形成。通过对初级成骨细胞的转录组分析，发现Piezo1 在软骨内成骨中的关键功能以及在骨重塑中起重要作用，表明Piezo1 是治疗骨骼疾病非常重要的靶点。Sun 等[20]也认为Piezo1 在骨形成中发挥重要作用，他们通过研究，发现敲除成骨细胞中的Piezo1 会破坏成骨细胞的成骨过程，从而严重损害骨结构和骨强度。通过模拟微重力治疗能抑制Piezo1 的表达而降低成骨细胞的功能。在骨质疏松症患者中Piezo1 表达减少，这与成骨细胞的功能障碍密切相关。Li 等[21]通过在体外培养骨细胞，用流体剪切应力刺激发现成骨细胞是通过Piezo1 感知和响应力学负荷变化，而小分子激动剂对Piezo1 的刺激能复制液体流动对骨细胞的影响。在成骨细胞和骨细胞中有条件地敲除Piezo1 基因则显著降低了小鼠的骨量和骨强度，证实Piezo1 是一个机械敏感离子通道。这些数据均表明，Piezo1 作为一个关键的机械敏感通道，可能会成为骨质疏松症或力学丢失引起骨量减少的一个新的治疗靶点。

5 Piezo 蛋白离子通道在关节软骨组织中的研究

软骨本质上是一种力学敏感的组织，软骨细胞作为唯一的细胞类型，在关节负重过程中不断暴露于不同的力学环境中。作为力学敏感细胞，软骨细胞能感知和反应负荷诱导的刺激，并有序地调节其代谢活动以维持软骨内环境平衡。因此，力学传导在软骨细胞中非常重要，Piezo 离子通道在软骨功能中的作用至关重要。研究发现软骨细胞中机械敏感通道Piezo1 和Piezo2 可稳健表达。与单压电表达相比，Piezo1 和Piezo2 的联合定向表达更能增强软骨细胞机械诱导的钙离子信号和电流的通过。Lee 等[16]也对软骨细胞中Piezo 通道（均为Piezo1 和Piezo2）的存在和功能进行了表征，通过采用实时定量反转录和免疫染色技术对分离的初级软骨细胞和膝关节软骨进行了检测，结果显示Piezo1 和Piezo2 均有表达。当软骨细胞中的Piezo1 和Piezo2 的表达基因沉默后，软骨细胞就没有了这种力学反应。Sauter等[22]研究发现线粒体呼吸链是机械损伤引起软骨细胞死亡的关键，撞击伤引起的软骨细胞死亡很大程度上取决于线粒体细胞骨架的联系。

杨骐宁等[23]通过建立人软骨细胞体外退变性应激刺激模型，采用多通道细胞拉伸应力加载系统X-4000T 治疗软骨细胞。根据预试验结果，加载频率为0.5 Hz 时，其细胞伸长率为20%。按细胞处理时间可分为0、2、12、24、48 h 机械应激组。使用RT-PCR和Western-blot 检测Piezo1 的表达，并使用激光扫描共聚焦显微镜检测Piezo1 的荧光强度，结果发现在人类退变软骨细胞中，新的机械敏感离子通道Piezo1蛋白有微量表达，施加周期性机械拉力后，压电蛋白的表达量随时间增加而增大。Du 等[24]研究结果表明软骨细胞可通过不同的机械敏感离子通道感知区分不同强度的重复机械刺激。其研究发现TRPV4主要负责感知重复性循环拉伸应变（cyclic tensile strains，CTS）生理性刺激，而Piezo2 主要负责感知重复性CTS 过度负荷水平，他们认为Piezo 通道介导的机械通道可能会成为治疗损伤性、重复性力学刺激所致的骨性关节炎的一种方法。

6 Piezo 蛋白离子通道在骨髓组织中的研究

骨髓组织的间充质干细胞是目前再生医学研究的热点，干细胞定向分化成骨细胞需要很多条件，通过对力学环境的感知反应是很重要的方面。Sugimoto等[25]通过研究，首次证明Piezo1 通道作为间充质干细胞系（mesenchymal stem cells，MSCs）中静水压力（hydrostatic pressure，HP）的受体发挥功能并促进其向成骨细胞分化，同时能抑制脂肪细胞分化。通过RT-PCR 检测，发现Piezo1 mRNA 在诱导分化小鼠成骨细胞MC3T3-E1 中有表达。通过研究HP 对MSCs细胞命运决定的影响进行研究，发现HP 促进骨分化的作用主要是依赖于骨髓间充质干细胞中Piezo1 调控的骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的表达完成。通过研究发现，作为Piezo1 的激活剂，HP 和Yoda1 促进了BMP2 的表达和成骨细胞分化，同时抑制了脂肪细胞的分化。而作为抑制剂GsMTx4 可降低成骨细胞分化和BMP2 表达。

7 Piezo 蛋白离子通道在椎间盘组织中的研究

椎间盘的退变离不开力学环境的改变，作为其中的髓核细胞在椎间盘的发病中起到非常重要的作用。Li 等[26]通过RT-PCR、免疫荧光、免疫组织化学、碘化丙啶分析等研究发现，人髓核细胞中高度表达的是Piezo1 蛋白离子通道。在异常负荷条件椎间盘退变患者中，Piezo1 蛋白可能通过对调节线粒体功能和内质网应激参与人髓核细胞的凋亡。同时也证实GsMTx4 阻断人髓核细胞的Piezo1 蛋白通道与细胞骨架密切相关。Yang 等[27]通过转染shRNAPiezo1 干扰载体，建立离体髓核细胞力学拉伸应力模型干扰其表达。采用RT-PCR 和Western blot 方法分别测定了Piezo1 蛋白水平，发现与空白对照组相比，张力组细胞质钙含量显著增加（P＜0．05），shRNA干扰组细胞内钙含量明显低于拉伸应力组（P＜0．05）；与空白对照组相比，拉伸应力处理可导致线粒体膜电位周转率显著升高（P＜0．05）；而shRNA 干扰组线粒体膜电位翻转率显著低于拉伸应力组（P＜0．05），他们认为ShRNA-Piezo1 通过降低细胞内Ca2+水平和线粒体膜电位的变化对细胞具有保护作用。这些研究均说明Piezo 通道参与介导了髓核细胞的退变凋亡，证实针对该通道的阻断或干预可作为一种治疗椎间盘疾病的新方法。

8 Piezo 蛋白离子通道与骨科疾病

戈登综合征或3 型远端关节挛缩是一种罕见的常染色体显性疾病，其发病特征是上肢和下肢挛缩，越来越多的研究发现戈登综合征与Piezo2 基因的杂合突变有关。该基因的不同突变还会导致5 型远端关节弯曲和马登-沃克综合征。这种离子通道的功能障碍可影响人体关节、眼肌和骨骼的发育。Alisch 等[28]通过对病例研究，发现很多患者往往表现出多个关节的挛缩以及包括上睑下垂在内的明显的面部表型；此外，还会伴随着轻度智力障碍和精神运动发育迟缓。也有学者研究发现远端关节弯曲症是一组临床和遗传学上的异质性疾病，包括多个先天性肢体挛缩，至少10 个临床亚型。Li 等[29]通过对两个中国患者轻度远端关节弯曲症的家庭采用TPM2、TNNI2/TNNT3、TNNC2 附近的微卫星标记进行两点连锁分析，绘制疾病位点图，应用PCR 限制片段长度多态性和生物信息学分析来鉴定两个家系的致病突变，结果在第1 家TPM2 中发现一个杂合错义突变，在第2 家Piezo2 中发现一个新的突变。TPM2 突变的类型和位置与临床特征没有相关性，不同的遗传模式和突变类型会引起不同的临床表现。当Piezo2 缺乏会引起脊柱关节畸形，当畸形进展时，需要手术矫正，以避免神经功能缺损和吸障碍[29-30]，由此可见Piezo 通道对人体的重要性。在骨肉瘤研究方面，Jiang 等[31]通过采用RT-PCR 和western-blotting 检测人骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）细胞中Piezo1 蛋白的表达。采用CCK-8、Transwell 实验和AV-PI 检测细胞增殖、侵袭和凋亡，结果Piezo1蛋白离子通道在OS 细胞中高度表达。通过shRNA抑制了Piezo1 的表达，2 h 牵张组的Piezo1 表达量略高于0 h 牵张组，其差异无统计学意义（P＞0．05），凋亡基因Bax、BAD、caspase-3、caspase-9 与在拉伸力作用下表达的Piezo1 具有相同的特征。通过在裸鼠体内对Piezo1 的侵袭进行研究，发现shRNA 能够抑制OS 细胞的侵袭。证实了Piezo1 通道在OS 细胞中的作用，其与细胞凋亡、侵袭和增殖的关系。Piezo1 蛋白可能是一种新的、有潜力的OS 治疗靶点。在疼痛方面有研究认为剪切应力和动脉血流变化可能会激活Piezo 通道导致偏头痛的发生[32]，针对该通道的研究可能为有效控制包括偏头痛和慢性疼痛在内的相关疾病开辟一条新的道路。

9 结语与展望

Piezo 蛋白离子通道属于目前机械敏感性离子通道中研究的热点，本文对其来源、结构、功能等进行系统回顾，重点阐述其在骨组织、软骨组织、椎间盘、骨髓组织等常见骨科疾病方面的研究进展。通过分析研究认为Piezo 机械敏感性离子通道在未来很有可能成为治疗骨关节疾病的新靶点。但是如何实现该通道在骨科领域发挥作用需要进一步进行研究，尤其是在成骨细胞、软骨细胞、髓核细胞等通过Piezo 离子通道感受力学信号后，究竟如何通过下游通路实现信号传导方面尚需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突