组织工程气管中生物可降解支架的选择与应用

潘子寅 潘枢 肖远帆 仲毅 史宏灿

扬州大学临床医学院胸心外科，扬州大学转化医学研究中心225001

0 引 言

人体气管呈中空管道状，主要由15～20 个C 形软骨及附有纤毛的上皮组织构成以实现其生理功能[1]。炎症、外伤及肿瘤等原因引起的气管疾病已日益常见，切除病变或狭窄部分并行端端吻合是其外科治疗的金标准，但最大的可切除气管长度不得超过成人气管长度的1/2 或儿童气管长度的1/3[2]。除此以外，由于供体器官来源有限，移植疗法不能被广泛推广使用。为了更好地解决这一问题，组织工程成为近年来气管修复的研究热点，其主要包括3 要素：种子细胞、生物支架以及促进收获细胞分化结构的生物反应器[3]。气管支架作为细胞黏附与生长的微环境，重要性不言而喻。根据不同气管疾病的具体情况，支架材料的选择不尽相同，但总体而言，理想的气管支架应具备以下特征：①良好的生物相容性，即无抗原性，能大大降低移植物的免疫排斥反应[4]。②生物可降解性，支架降解产物的安全性必须经过测定，且支架降解速率适宜并可调节。③足够的机械强度和生物柔韧性。④能提供三维多孔结构，利于营养物质转运及细胞黏附[5]。⑤支架材料较易从自然可再生物质中提取或通过简单流程合成制造。因此，生物可降解支架应运而生，但在临床气管修复治疗中运用仍不多。本文将着重介绍不同支架材料的可降解性及其在组织工程气管领域的应用前景。

1 生物可降解支架材料的分类

1.1 天然高分子物质材料支架

天然高分子物质材料支架的构成物质主要从动植物中提取。该类支架按其材料的分子构成主要分为多糖类和蛋白质类。前者包括壳聚糖、藻酸盐、透明质酸[6]等，后者包括胶原[7]、丝素蛋白、明胶等。其中，丝素蛋白、壳聚糖和藻酸盐目前在组织工程气管中应用较为广泛。

1.1.1 丝素蛋白

丝素蛋白是一种可从家蚕中获得的纤维蛋白，以甘氨酸和丙氨酸为主要氨基酸残基，由蛋白质自身组装的β-折叠结构形成，该结构使丝素蛋白支架具有较好的稳定性，机械性能也得以提高[8]。几种常见的细胞或细胞系如内皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs)等[9]，均能黏附于丝素蛋白支架上，并表现出较好的生物活性和细胞功能性。丝素蛋白在体内会随着时间的延长而逐渐降解，降解过程主要由蛋白酶介导，降解产生的多肽可由细胞完全代谢，对人体无毒副作用[10]。因此，以丝素蛋白为基础制备的支架逐渐受到学者的关注与研究。Li 等[11]将丝素蛋白以水凝胶的形式注入大鼠后肢及背部皮下，每隔4 d 使用多模超声技术探测丝素蛋白植入物表面新血管在体内的形成情况以及植入物的生物降解速度，观察直至第20 天。结果证明质量浓度为40 g/L 的丝素蛋白于植入后的前16 d 主要以水解和吞噬的形式降解，于植入后第18～20 天快速降解并与周围微血管一并形成新生血管。组织工程气管中成功移植的关键在于呼吸上皮、软骨、血管的再生，因此，丝素蛋白支架在组织工程气管中有着巨大的应用潜力。无独有偶，McGill 团队[12]在手术诱导的具有严重气管软化症状的新西兰兔中植入丝素蛋白外部气道夹板，于观察时间点均发现气道面积的平均变化量减少，证实了丝素蛋白夹板在气管严重软化的兔模型中具有良好的耐受性和有效性，植入后气道塌陷情况得到显著改善。虽然丝素蛋白材料具有种种优势，但将其应用于组织工程之前仍有一些问题尚待解决，如：①如何提高支架的柔韧性与伸缩性，减少对创面的伤害。②如何更好地匹配所制支架的降解速率与靶组织的再生速率等。

1.1.2 壳聚糖

壳聚糖在结构上类似于软骨中存在的糖胺聚糖，通常可从甲壳类动物（如虾、蟹和昆虫）的外壳或藻类、菌类的细胞壁中分离提取。它是一种具有抗菌活性的多功能化合物，也是目前唯一发现的天然碱性黏多糖。壳聚糖具有可降解性及生物黏附性，降解产物为单糖，对人体组织无毒性作用[13]。Pang 等[14]制备了与氨中和的壳聚糖支架，压力测试结果显示其达到压缩极限时，仍能保持与原来相似的机械性能且具有良好的弹性。此外，体外培养实验结果发现该支架有利于新西兰兔MSCs 的黏附。Nematollahi 等[15]采用冷冻铸造技术制备了一种壳聚糖丝质支架，并选择了3 种固结速率和3 种质量分数的交联剂（戊二醛）来改变支架的机械性能及孔隙率。基于拉伸强度、杨氏模量和降解速率的测量结果选出两种合适的支架用于体外细胞培养，结果显示使用1 ℃/min 和2 ℃/min 的冷冻速率以及质量分数为0.8%的交联剂制备的壳聚糖支架具有与人原生气管最为相容的无毒多孔结构。此外，支架表面软骨细胞良好的黏附与增殖现象证实了该支架用于软骨再生的能力，这与气管工程的目标点所契合。然而作为一种天然材料，壳聚糖支架的机械强度有待提高，形态变化规律不太明确，包封于支架中的生长因子的释放速率需得到更好地控制。这些问题同样需要在未来的研究工作中进一步探索[16]。

1.1.3 藻酸盐

藻酸盐是从褐藻中提取的一种天然亲水性多糖，水解产物主要是D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸[17]。作为一种天然高分子生物材料，藻酸盐不仅兼具良好的生物相容性和生物可降解性，还可形成胶状载体。由于纯化后毒性低、结构与细胞外基质相似、利于细胞黏附生长，藻酸盐支架逐渐在组织工程研究中受到青睐。Hashemibeni 等[18]用藻酸盐支架包裹自体脂肪来源干细胞，并利用转化生长因子β3诱导干细胞分化为软骨细胞，再将软骨细胞植入气管环缺损处，甲苯胺蓝染色结果证实缺损处有软骨组织的形成。

由上可知藻酸盐材料具有诸多优点，但也不可避免地存在一些缺陷大大限制了其在组织工程中的应用，如支架力学性能较差、存在pH 敏感性等。近年来，通过物理共混（在其中掺入一种或多种其他材料）和化学改性方式（支架材料的接枝改性以及采用细胞特异性配体和细胞外基质信号分子对材料进行功能化修饰）已经可以在一定程度上弥补藻酸盐材料的缺陷[19]。Ceccaldi 等[20]和Liao 等[21]分别使用藻酸盐泡沫支架以及藻酸盐水凝胶复合负载葡萄糖/钙的多孔微球形成的支架，均在组织工程软组织中取得了进展。

1.2 人工合成聚合物材料支架

天然材料支架本身能促进细胞黏附、增殖分化，并具有良好的生物相容性；但其缺点也很明显，如力学性能不佳、降解速率不易控制、性能变化与结构变化较难预测等。因此人工合成材料支架应运而生，并具有自身的独特优势，如性能易于调控、可根据患者的特定要求和尺寸量身制造、理想状态下较易被有效地杀菌消毒。过去几年中，不同类型和组合的人工合成材料支架已陆续出现和被使用。

1.2.1 聚羟基乙酸

聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA），又称聚乙醇酸，是由乙醇酸经脱水缩合反应得到的聚合物。在人体活性酶的催化下，PGA 可分解成为水和二氧化碳，经肺部和肾脏排出体外，对人体无毒副作用。目前，PGA 主要用于手术缝合线的制造。此外，将PGA 材料填入软骨撕裂破损处，可明显缓解因软骨缺损而带来的不适症状[22]，说明其对软骨再生具有一定的应用意义。目前组织工程气管面临的一大难题为如何提升血管再生的性能，以使气管替代物在植入后的初始阶段得到足够的血液供应以维持组织的生存需要。而PGA 支架被证明能在一定程度上协助解决该问题。Li 等[23]将胰岛移植物经内皮细胞包被后附着于PGA 支架上，苏木精-伊红染色及双重免疫荧光染色结果显示该支架能提高内皮细胞对胰岛的包被效率，且辅以血管内皮生长因子可促进血管再生的进程。除了有助于软骨组织与血管的重生，PGA 支架对于组织上皮化也卓有成效。1992年Okumura 等[24]在修复成年犬损伤气管的过程中，将可降解的PGA 网织物与非降解性聚丙烯材料进行对比，发现随着时间的延长，PGA 网织物表面的上皮细胞数量以及黏膜下结缔组织的厚度均明显大于聚丙烯材料组，因此从气管损伤处伤口愈合的角度来看，使用可降解性支架更为合适。PGA 支架对于组织工程气管体内构建的关键因素具有积极意义，但其仍有很大的改进空间，如机械性能有待提升，使其受力不易变形，避免损伤种子细胞；调控其在人体内的降解速率，解决其降解过快的问题等。

1.2.2 聚乳酸

聚乳酸是一种脂肪族聚酯高分子聚合物，可通过生物发酵法制备。由于聚乳酸同样具有无毒无刺激性等优势，一直以来亦为学者研究的重点，且被认为是最具前景的支架材料。除了生物相容性良好以外，聚乳酸的另一大特点为具有生物可降解性，其降解产物为乳酸（在体内3～6 个月可被完全降解），进入三羧酸循环后最终以二氧化碳和水的形式排出，对人体较为安全。但也有学者认为降解产生的乳酸形成的酸性环境会影响细胞的生长[25]。聚乳酸与PGA 的结构较为相似，相比之下，聚乳酸分子中的酯键更耐水解，使得聚乳酸疏水性能更强进而改变了聚乳酸支架的降解速率及机械稳定性。但单一的聚乳酸支架的脆性不能提供气管替代物所需的机械灵活性[26]，为解决这一问题，通常在聚乳酸支架中加入不同材料制成复合支架以提升支架性能，其中使用较多的为聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架（由聚乳酸和PGA 共聚复合得到）。Schopf 等[27]报道了第1例PLGA/聚异戊二烯复合支架植于新西兰白兔气管壁，创新性地使用了螺旋支架模型，并与单纯片段形式进行对比。结果显示，螺旋支架组的组织炎症反应大于片段组，推断该现象是因支架对组织的机械损伤所致，而非支架接触反应；此外还发现实验动物气道分泌物积聚引起的气道阻塞与植入支架壁的厚度过大有关，这对未来的研究起到启示作用，未来应在如何尽可能减小支架壁厚度并结合3D 打印技术改进支架形状方面投入更多的精力。

1.2.3 聚己内酯

聚己内酯是生物可降解聚酯成员之一，是一种脂肪族半结晶聚合物，具有良好的形状稳定性与生物相容性。聚己内酯支架具有良好的药物透过性，并能长期稳定地释放药物。均质状态下，聚己内酯的降解速率较聚乳酸和PGA 慢[28]，在人体内降解需2～3年，降解后无毒副产物[29]，可用作长期可生物降解植入物的基础聚合物。聚己内酯因强度较差，加之天然的疏水性，一般不作为单一材料使用。近年来，对于聚己内酯的改造组合取得了进展。Morouço等[30]在聚己内酯材料中渗入纤维素纳米纤维这一高分子聚合物作为强化填充剂制备复合支架，在很大程度上提升了支架的抗压能力，且其降解速率可控。细胞毒性实验结果证明该复合支架无毒、生物相容性良好。目前除了上述对聚己内酯材料的改造方法，聚己内酯已主要通过3D 打印技术应用于气道重建。Steffens 团队[31]将3D 打印聚己内酯支架与MSCs混合，分别于电子扫描显微镜和共聚焦显微镜下观察，结果发现与传统的2D 支架相比，3D 打印聚己内酯支架更有助于观察种子细胞间的相互作用，并大大缩短了组织/细胞的更新时间，这对于再生医学意义重大。

2 构建可降解组织工程气管支架的主要影响因素

组织工程气管支架的降解方式对其在体内的构建效果具有巨大影响。不论是天然复合物材料支架还是人工合成聚合物材料支架，均有两种降解方式：表面降解和本体降解[32]。在表面降解中，材料随着时间的推移逐层被侵蚀，在保持支架原有形状的前提下降低支架厚度；在本体降解中情况变得不同，材料以崩解的形式降解，即材料表面和内部同时分解、溶解或降低相对分子质量，导致材料强度下降，最终出现解离的现象。当需要保持气管替换物的结构完整性时，考虑这两种降解方式的差异性显得尤为重要，若材料降解速度太快，气管管腔塌陷的可能性更大，从而导致移植失败。在支架降解过程中，必须保证依附于其上的种子细胞能承受外部环境的变化。理想状态下，支架的降解速率应是可塑的，能与新组织的形成速率相匹配，一旦新组织形成，支架也应近乎完全降解，而这取决于材料的组合方式、化学键的类型及外界环境的pH 值等因素。例如，聚L-乳酸与壳聚糖复合后降解变慢，可用作组织再生的引导膜[33]；偏酸性材料在碱性环境下降解极快；由于聚己内酯材料分子的重复单元中存在5 个疏水性—CH2基团，因此聚己内酯在所有聚酯中降解最慢[34]。除了考虑支架的降解速率，还应尽量保证其降解产物无毒副作用，对人体不造成潜在危害。

3 构建可降解组织工程气管支架的新型方式

随着生物打印技术的不断发展进步，可降解支架材料与之结合应用的实例不断涌现，在组织工程中展现出的应用潜力已不容忽视。3D 生物打印技术是在计算机辅助设计软件的帮助下，通过简单几何图形的组合实现复杂结构的设计，运用可黏合生物材料通过逐层打印的方式构造目标打印物的一种技术[35-36]。3D 打印生物支架根据用途可分为两种，一种通常称为细胞培养支架，提供细胞迁移、增殖、分化的微环境，且不会降解；另一种为3D 组织工程支架，用于组织植入和生长，经过一段时间在体内降解[37]。在组织工程领域以研究后者为主。Asnaghi等[38]采用3D 打印技术特定设计与患者原生气管相匹配的支架，治疗了1例先天性气管支气管软化症患儿。手术中切除局部病变气管，将支架缝合至需要替代的缺损处。该植入支架预计将在3年左右的时间被患儿机体吸收和降解，该过程并不影响患儿术后的生存质量，且随着患儿自身的生长发育，远程效果良好。上文已述，可降解天然支架材料和人工合成材料各有明显的优缺点，若能对材料进行改性或复合使用，或许能取长补短，制备出拥有不同孔隙率及与组织降解速率相匹配的复合材料支架，而这些可通过3D 技术较好地实现。为了解决聚己内酯的疏水问题以及提高支架的机械稳定性，Ghorbani 团队[39]将天然材料胶原蛋白与3D 打印聚己内酯框架相结合构建了一种组织工程气管支架，在支架上接种初级软骨细胞与脂肪来源MSCs 并将支架缝合至脱细胞主动脉，最后异位植入新西兰兔中。组织学染色结果证实支架上有软骨组织形成，组织分泌的细胞外基质中存在糖胺聚糖；经体内培养后发现几乎无因支架植入而带来的免疫排斥、炎症或感染症状。此外，该复合支架的拉伸强度与天然气管相当，细胞在其上黏附状态良好，这为组织工程气管提供了所需的刚性与生物相容性。

在3D 打印支架的递送过程中，细胞会不可避免地受到热量、振动和剪切力的影响，影响程度大小取决于3D 打印所采取的方法及所选的材料。支架的免疫原性仍是必须解决的问题，需进一步对支架降解过程中释放副产物的短期和长期影响进行评价[40]。为解决3D 打印技术的一系列问题，4D 打印技术已初露头角，其能在“时间”上打破3D 打印技术的静态局限：4D 打印支架以临时状态被移植，当于体内触发其形状记忆时，支架能恢复目标形状并与机体的解剖结构相匹配。但因4D 打印技术的创造性强、应用程序多且难度大，其在气管重建领域的运用仍不够成熟。虽然如此，生物打印技术可根据患者的具体情况构建拥有不同生物性能的材料复合型支架，使其更具有针对性，提高治疗效率，这为功能性合成组织器官的生物医学领域应用提供了一个新颖的平台[41]。也正因如此，各种生物可降解材料定会引起专家们更为广泛的兴趣，发挥更大的作用。

4 展 望

生物可降解支架以其高分子性能和组合多样性成为目前组织工程领域研究的热点，而3D 打印作为一项新兴生物科学技术，为气道重建的研究提供了新方向，两者结合使用的效果令人期待。但目前仍有一些问题需进一步的研究以解决，如能否成功减轻支架植入后的免疫反应、能否在较短的时间内为患者完成支架的个性化定制、能否做到对支架降解速率的精细控制等。随着现代医学多学科的不断交叉互补，未来人们终将探索出最适宜人体内环境的生物可降解材料支架，成功解决组织工程气管在气道重建中的瓶颈问题，取得实质性突破。

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