烟碱受体细胞内相互作用蛋白研究进展

潘振华 杜丽敏 王举 陈军

1天津医科大学总医院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室，300052；2天津医科大学生物医学工程学院300070

0 引言

烟碱受体（nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs）是乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的主要受体之一，属于配体门控离子通道蛋白超家族，该家族成员还包括γ-氨基丁酸受体、甘氨酸受体和五羟色胺受体等。与其它成员一样，nAChRs由五个同源亚基围绕中央离子通道形成近似对称的五聚体蛋白，每个亚基由一段长度为200个氨基酸（aminoacid,AA）左右的细胞外氨基末端、四段跨膜螺旋（M1-M4）、一段短的羧基末端和M3-M4之间细胞内环（intracellular domain,ICD）组成。目前在人类基因组中已经鉴定到5个肌肉型nAChR亚基（α1，β1，γ，δ，ε）和11个神经型nAChR亚基（α2-α7，α9，α10，β2-β4），它们广泛地分布于神经系统和非神经系统中，发挥着重要的生理功能[1-5]。

越来越多的蛋白结构生物学数据给出了烟碱受体除ICD之外的结构信息，研究者们不仅能够清晰描绘出经典的配体结合口袋，还证实了nAChRs的变构蛋白特征，鉴定到变构调节分子的结合和调控位点，并研究和开发出了选择性更高的激动剂、拮抗剂和变构调节剂分子，以实现在戒烟、镇痛、增强认知和抗抑郁等过程中对nAChRs功能的靶向调控[1-8]。然而，ICD部分的结构与功能仍有待研究。不同于其它结构区间，ICD在亚基之间存在很大差异，序列长度为78～259 AA不等，但同一个亚基的ICD在物种进化过程中却高度保守，提示了该序列的功能重要性。大量研究证据表明，调控亚基细胞内表达、代谢及下游信号功能的主要位点分布在ICD，如，将蛋白嵌合体中α7亚基的ICD替换为α3或者α4亚基的ICD，能直接改变受体的组织分布[9]。

互作蛋白分子及蛋白之间的相互作用关系往往有助于推导特定蛋白的功能及功能位点信息。如，通过对神经递质N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）的研究，发现它们能够集合成由多达186个蛋白分子组成的复合物，而将复合物中这些分子进一步富集，能拓展到1 124种蛋白分子。通过这个研究结果，可推测到由谷胱甘肽或其它NMDAR的配体分子能够激活一系列不同的信号转导，包括基因转录、细胞骨架重排，以及蛋白合成、降解和转运[10]。继NMDARs之后，在过去的几十年里，对于nAChRs互作蛋白的研究不断有报道；同时，随着蛋白质组学技术的发展，逐渐呈现出nAChRs相关的蛋白质互作网络结构。而对nAChRs的蛋白质互作网络结构的解析，将有助于进一步阐述nAChRs的生物学功能以及与其相关的疾病机制。

1 烟碱受体的细胞内代谢调控

新合成的烟碱受体亚基在内质网（endoplasmic reticulum,ER）中折叠和组装为成熟的受体，继而由ER转运到高尔基体，再由高尔基体转运到细胞膜上表达并发挥功能。细胞膜上的受体在细胞内吞作用下，进入蛋白酶体发生降解，而未组装的亚基和错误折叠的亚基可经ER相关降解（ER-associated degradation,ERAD）途径降解与回收。在此过程中，烟碱受体会受到多种蛋白分子的调控，而研究结果发现，这些调控分子与受体的结合位点主要在ICD[9,11-12]。

1.1 内质网蛋白调控受体的折叠与组装

ER伴侣蛋白BiP、Calnexin和ERp57会迅速与新合成的亚基多肽结合，以辅助亚基之间进行组装。BiP与亚基结合时间短，而Calnexin和ERp57与亚基的结合持续时间较长，以维持亚基在ER内的滞留。Calnexin具有凝集素结合域，一般与N-糖基化的天冬氨酸通过凝集素结合域互作，但近期研究发现，Calnexin与nAChR亚基的互作并不依赖于N-糖基化，进一步实验鉴定到，Calnexin与ERp57往往同时出现在与nAChR亚基结合的蛋白复合体中，而ERp57可通过短暂的分子间二硫键结合到亚基上，由此推测Calnexin与烟碱受体亚基的结合很可能是通过复合蛋白中ERp57等其它成员与亚基的相互作用[11,13]。

拮抗胆碱酯酶蛋白RIC-3也是ER分布的跨膜蛋白，与ER中未组装的nAChR亚基结合，促进亚基的折叠和组装。与BiP、Calenxin不同，RIC-3与nAChR亚基的结合是高度选择性的，特别是对α7受体的成熟具有非常重要的促进作用[14-15]。

富含半胱氨酸和表皮生长因子样区域蛋白CRELD2被发现在ER中与α4β2受体共定位，且特异性调控α4β2的组装和细胞膜表达。酵母双杂交实验证实，α4-ICD的331-381肽段是CRELD2β结合的主要位点[10,16]。

在一些哺乳动物细胞系中，烟碱受体亚基的折叠效率依赖于正确二硫键的形成，不恰当的二硫键会阻碍亚基的有效折叠。在爪蟾卵母细胞中发现，α7亚基的折叠效率受到脯氨酰异构酶（Cyclophilin）的调控[17]。

1.2 成熟受体的转运

钙离子感受蛋白VILIP-1，是在脑组织中以α4为诱饵蛋白进行酵母双杂交鉴定到的互作蛋白，其参与调控烟碱受体的运输。VILIP-1包含3个功能型钙离子结合EF-hand结构域，其中α4-ICD（302-339肽段）是α4与VILIP-1互作的必要序列结构。VILIP-1与α4的互作能够上调α4β2型受体在细胞表面的表达，并增加对ACh的敏感性[17]。

在肌肉型受体、β2和β4亚基的ICD鉴定到了控制ER输出的结构域。在人类β2和β4亚基中，靠近跨膜区域M3的LFM-motif被鉴定为受体从ER转运出的标识序列；而位于β2-ICD中段的RRQR-motif被鉴定为ER滞留信号。研究者们在少数渐冻症患者基因组中鉴定到β4亚基靠近ER输出结构域的R349C位点突变，该突变可引起ER输出位点的减少以及受体在细胞膜的表达量降低，这与疾病的发生直接相关。对尼古丁分子的研究发现，尼古丁分子能够促进α3β4受体以（α3）2（β4）3的形式聚合，从而增加了β4的数量以及相应的ER输出结构域的数量，这个结果解释了慢性尼古丁诱导增加了表面受体的现象[9,11]。

近期研究发现，在α1亚基ICD存在两个相邻的碱性氨基酸位点，这两个位点能够被COPI复合体识别，从而促进成熟受体由ER输出转运到高尔基体[18]；而位于高尔基体的跨膜蛋白UNC-50能够选择性地调控一些烟碱受体亚型从高尔基体向细胞膜的转运，并且这种调控作用是必不可少的[10,19]。与成熟受体不同，未组装完全的nAChRs会受到ER膜蛋白Rer1等的结合和约束，以阻止其从ER逃逸到胞浆中[20]。

1.3 受体的降解与回收

除了ERAD，烟碱受体蛋白也受到蛋白酶体-泛素降解机制（ubiquitin-proteasome system,UPS）的调控。接头蛋白Ubiquitin-1可通过结合到α3亚基，将其转运到蛋白酶体，继而限制亚基的组装和向细胞膜的转运，最终降低α3β2受体在细胞膜的表达[21-22]。

另外，两种接头蛋白UBXD4和UBXN2A被证实可阻断α3亚基的降解。其中UBXD4在神经组织和非神经组织中都有表达，细胞内主要分布于ER和高尔基体。有证据表明，UBXD4可能通过阻断α3亚基的降解，从而增加其在细胞表面的表达以及增强对ACh的应答。在UBXN2A与α3的结合蛋白复合体中，还鉴定到VCP/p97、HSC70/HSP70和CHIP；进一步研究证实，UBXN2A可通过干预具有E3连接酶活性的CHIP蛋白与α3亚基的结合，从而抑制亚基的降解，并促进α3受体的成熟和转运[23-24]。

2 膜蛋白和骨架蛋白调控受体的聚集与稳定性

通过构建嵌合体和免疫沉淀实验，验证了骨架蛋白Rapsyn能与β1亚基直接互作，它们之间的互作关系，能够调控肌肉型受体在神经肌肉连接处（neuromuscular junction,NMJ）的聚集和稳定；同时，它们之间的互作关系，依赖于β1-ICD酪氨酸位点的磷酸化[17]。Rapsyn蛋白在神经系统中也得到了鉴定，但研究发现，Rapsyn并不参与α3β2或者α4β2受体在细胞表面的表达调控。此外，Rapsyn在内耳中也有表达，并且与α9-ICD互作，能够增强α9型受体在细胞表面的聚集[25]。

骨架蛋白PSD-95家族成员包括PSD-93、PSD-95、SAP97和SAP102，它们都被证实能与烟碱受体互作。PSD-95家族蛋白结构中都含有PDZ结合域，一般情况下，PDZ结构域主要是和蛋白分子的细胞内C末端区域结合；而越来越多的研究结果指出，该家族蛋白也可通过PDZ-domain与nAChRs的ICD发生相互作用，如PSD-93与小鼠神经组织中的烟碱受体互作，以维持受体稳定性。在HEK293细胞模型中，PSD-93能与含有α3和α5的受体以及α4β2受体结合，而SAP102只和含有α5的受体结合。在HEK293细胞和鸡的纤毛神经节神经元中，PSD-95与α3和α5亚基结合，而不与α4β2或α7受体结合[17]。

酵母双杂交和Co-IP研究结果证实，α3-ICD和α4-ICD都具有接头蛋白14-3-3的结合位点，在α3-ICD是RSSSSES肽段，在α4-ICD是RSLSVQ肽段。它们之间的结合能够调控受体的稳定性和细胞内的运输，以增加特定亚型的受体在细胞膜的表达[9,26]。Co-IP实验还鉴定到，肌肉细胞细胞膜微囊的蛋白组分caveolin-3与α1亚基互作，从而影响肌肉型受体在NMJ的聚集与稳定性，并推测它们之间可能是通过caveolin结合域连接[27]。此外，还有一些研究者们发现，α7受体、α4β2受体的ICD区域都可与支架蛋白β-arrestin1互作，并调控酪氨酸激酶Src的活化[28-29]。

3 下游信号调控

传统研究认为nAChRs在体内发挥的是阳离子通道功能，在内源性配体ACh和外源性配体尼古丁分子等的激活下，将Na+、K+和Ca2+等电流信号转化为细胞内化学信号。近期，更多的研究开始关注nAChRs非离子通道依赖型的下游信号调控，即代谢型受体功能。这些下游信号的改变，能直接影响细胞的骨架结构、增殖与分化、存活和多种细胞因子的分泌。现有证据表明，nAChRs对细胞内下游信号的调控，主要是由通过其ICD构象改变以及与其它蛋白分子之间的相互作用关系来介导的[9,30]。

3.1 Wnt信号通路

已知腺瘤性结肠息肉病蛋白APC可通过接头蛋白14-3-3与α3亚基结合，APC参与经典Wnt通路的调控，并且Wnt通路的配体蛋白Wnt-7a可调节大鼠海马区突触神经元中APC与α7受体的共聚，以有效增强α7受体在前突触位点的聚集。研究者们由此推断，nAChRs信号通路与Wnt通路之间存在相互调控关系[31-33]。

3.2 G蛋白信号通路

蛋白组学研究鉴定到多种nAChRs受体复合物中存在G蛋白成分，如通过对β2亚基的组学实验鉴定到，β2可能通过与Goα的互作调控下游G蛋白信号转导[10,34]。定点突变实验证实α7受体的ICD具有能与Gαq发生结合的序列区域（345-348肽段），α7受体可在不依赖离子通道开放的状态下通过直接与G蛋白互作，来调控下游包括钙离子在内的信号转导[2,30,35]。

3.3 基于α7受体的发现

α7受体是近年来最受关注的烟碱受体类型之一，α7受体不仅在大脑中含量丰富，同时也是迷走神经调控的胆碱能抗炎信号通路中的重要调节分子，其参与JAK2/STAT3信号通路、NF-κB的活性调控。α7-ICD结构在所有nAChR亚基蛋白中是最保守的，通过真核生物蛋白短序列功能肽分析，鉴定到α7-ICD区间存在多个丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化功能位点、MAPK信号家族调控位点以及与接头蛋白复合物的互作位点[9,36-37]。

4 蛋白质组学研究

几项大规模蛋白组学研究分别针对α7受体、α4β2受体的互作蛋白进行了鉴定和分析，且主要是针对脑组织，包括人脑和小鼠神经组织。其主要方法均是采用特异性亲和力配体（α-bgtx）或抗体进行结合与分离；对比亚基敲除的转基因小鼠组织或细胞。有团队较Paulo团队改进了α7的分离和纯化方法，由Paulo团队鉴定的55种互作蛋白，丰富到了121种α7互作蛋白，包括α7本身。通过STRING和KEGG富集分析，α7在神经组织中的互作蛋白网络既包括其细胞内代谢相关调控蛋白，也包括与AD、PD等神经疾病相关的蛋白分子。此外，还鉴定到α7的互作蛋白网络中，有一部分蛋白分子与NMDARs的互作蛋白网络重合，研究者们推测可能与NMDARs存在竞争结合关系[38-39]。

McClure-Begley等[40]鉴定到78种与β2受体互作的蛋白，并给出了这些蛋白分子的细胞内亚分布，同时还采用iTRAQ定量比较了尼古丁诱导下的互作蛋白谱系改变；Miller等[41]通过质谱鉴定到α4亚基ICD上8个重要的磷酸化位点，证实与PKA、PKC及CaMKII的相互作用，以及对下游信号的影响。

质谱研究可较全面地鉴定到与特定亚基存在互作关系的蛋白分子，iTRAQ还可实现一定程度的定量。不过，对于蛋白复合物的分离和纯化，特别是非特异性蛋白分子的污染，是提高质谱鉴定结果的关键。

5 结语

nAChRs在细胞膜的表达和功能以及在细胞内的代谢和下游信号传递，受到多种互作蛋白的调控，而这些互作蛋白与nAChRs的结合位点主要集中在ICD区间，并且受到ICD位点磷酸化、糖基化、棕榈化以及二硫键等的影响。包括Src家族在内的酪氨酸激酶、PKA及PKC在内的丝氨酸/苏氨酸激酶等，被证实与不同亚型的nAChRs结合，并且在受体表达与功能的平衡中起到重要的调节作用[1-2,9,42-44]。

目前，对烟碱受体ICD的结构以及细胞内的功能尚缺乏明确的阐述，通过对烟碱受体互作蛋白的研究，有助于探讨烟碱受体的生理功能及相关疾病机制。比如，最初研究者们鉴定到肌肉型烟碱受体的突变与先天肌无力综合征（congenital myasthenic syndrome,CMS）相关，而后续研究发现，除烟碱受体自身突变之外，nAChRs互作蛋白Rapsyn等的突变同样也会引起CMS的发生[10]。

同时，通过对互作蛋白结构与互作位点特征的研究，有助于进一步解析烟碱受体ICD部分的结构。由于nAChRs的ICD序列对于每个亚基具有更高的特异性，因此靶向这个区域的调控对于特异性调节亚基功能具有很大的潜力。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突