脂肪干细胞联合水凝胶材料在组织工程中的研究进展及前景

张栋鑫 肖丽玲

暨南大学附属第一医院整形外科，广州510000

0 引 言

组织工程是一个新兴的学科，融合了工程、生命科学和医学等多个学科领域，其研究对象主要包括细胞、生物材料和生物反应器三个部分。三者相结合可构建三维人造组织和器官，用于增强、修复或更换受损或患病的组织。2001年，Zuk[1]首次从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），并指出ADSCs具有多向分化潜能，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、肌细胞等。后来，研究者又证实ADSCs能分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、人类生长因子（human growth factor，HGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板生长因子（polypeptide growth factor，PGF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin-like growth factor-binding protein，IGFBP）、血管紧张素（angiotensin，Ang）等[2-3]。此外，由于ADSCs具有容易获取、增殖速度快、细胞同源性好等特性，近年来成为组织工程中比较理想的种子细胞。水凝胶（hydrogel）是一类包含大量水分的三维聚合物网络材料，这类材料具有优异的生物相容性、良好的弹性、可预测的降解率以及可调节的机械性能，且水凝胶的性质可以被任意调整以提升其细胞黏附或促进细胞功能（迁移、增殖和分化）的性能。上述优点使水凝胶成为一种优秀的生物医学材料[4]。本文中，对ADSCs联合水凝胶材料在组织工程中的研究进展和应用进行综述，并对其未来的研究重点做出展望。

1 皮肤组织工程

皮肤再生是各种烧伤和慢性创面愈合的重要过程，在创面缺血微环境的影响下，皮肤组织工程中种植在支架上的ADSCs很容易凋亡。为了解决这个问题，研究者提出了ADSCs-水凝胶系统。间充质干细胞进行自发脂肪分化，促进表皮和真皮在伤口愈合过程中修复和生成皮肤的基本结构[5]，生成的脂肪细胞可以与巨噬细胞协同清除伤口床上的细胞碎片，并分泌与伤口愈合相关的各种生长因子和细胞因子[6]，可见脂肪细胞在创面愈合中起着关键作用。血管形成是皮肤组织工程治疗创面中的关键环节。Eke等[7]利用明胶、透明质酸设计了一种包含ADSCs的光交联水凝胶，并将其作为真皮替代物植入大鼠创面中；其观察到的血管生成表明，该水凝胶系统促进了创面愈合并提高了组织工程皮肤存活率。Tan等[8]的研究结果表明，脱细胞脂肪组织水凝胶负载ADSCs可诱导创面脂肪细胞生成，并促进创面愈合。水凝胶不仅可以在受伤早期对伤口提供暂时的保护，避免感染，还可以通过刺激ADSCs释放VEGF来促进缺血损伤模型中的血管生成，提高创面的愈合率，减少瘢痕挛缩。Lin等[9]制备出温敏型Pluronic F-127水凝胶，包封ADSCs后注射入糖尿病鼠模型的创面，结果证实这种水凝胶系统具有良好的生物相容性，其能使大量细胞黏附在凹陷部，有效促进创面愈合。Chang等[10]报道了一种可注射 的1-氨 基-3，3-二 乙 氧 基 丙 烷-透 明 质 酸（hyaluronic acid，HA）-壳聚糖（chitosan，CS）水凝胶，这些包裹ADSCs的凝胶具有良好的生物相容性，并能促进细胞增殖、增加角质形成细胞的迁移、促进肉芽组织的形成、促进创面毛细血管的形成，从而加速创面愈合。Zeng等[11]制备了可注射的明胶微冰胶（gelatin microcryogels，GMs）负载ADSCs的水凝胶系统并作用于皮肤创面，GMs为ADSCs提供了功能化的微生态位，以保持细胞的增殖，提高干细胞的基因表达和生物活性因子的分泌，同时保护细胞免受炎症刺激，最终显著提高促进皮肤创伤愈合的效果。Dong等[12]将超支化聚乙二醇二丙烯酸酯[hyperbranched poly-（poly-（ethylene glycol）diacrylate，HB-PEGDA]聚合物、一种商业上可用的硫醇功能化透明质酸（HA-SH）和一个短rgd肽组成一个水凝胶体系，这种凝胶溶液可在进入体内后5 min内形成凝胶，避免了ADSCs的流失，同时rgd肽增强了水凝胶体系对细胞的黏附能力，将这种体系植入大鼠烧伤创面模型后加速了创面愈合，减少了瘢痕形成。Samberg等[13]利用聚乙二醇[poly（ethylene glycol），PEG]改性富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）使其凝胶化，形成的水凝胶体系不仅可作为ADSCs支架，而且可长期释放生长因子，促进创面血管化和愈合。综上，水凝胶支架包裹ADSCs形成的体系可以被认为是治疗各种类型皮肤缺损的一种很有前途的方法。

2 脂肪组织工程

当正常软组织外观因慢性疾病、创伤或肿瘤切除而受损时，脂肪组织工程便成为一种可行的解决方法。然而，由于脂肪是一种高度血管化的组织，因此脂肪组织重建的结局在很大程度上取决于植入后血管化的情况。ADSCs除了有较强的脂肪分化能力、抗凋亡能力外，其还可通过旁分泌效应分泌VEGF等，使其在血管化脂肪组织工程中有着良好的前景。Zhang等[14]将己二酰肼交联PLGA成水凝胶，冻干后形成多孔结构，使ADSCs在结构中聚集成球状体，较高的细胞密度造成了微缺氧环境，增强了ADSCs的旁分泌效应，在ADSCs分化为脂肪细胞的同时促进了血管生成，促进血管化脂肪组织的形成。棕色脂肪组织具有很强的耗能及产热能力，是治疗肥胖和代谢性疾病的潜在靶点，但其在体内含量有限。Vaicik等[15]将ADSCs在聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶中诱导分化为像棕色脂肪组织一样活动的“米色”脂肪组织，为移植到体内改善代谢活动提供了可能。

3 骨组织工程

骨组织工程是指通过诱导ADSCs向成骨细胞分化，从而促进骨的修复和形成过程。为了达到这个过程，可将包裹ADSCs的水凝胶作为物理稳定剂，在体内和体外诱导原位干细胞分化。

Debnath等[16]报道了一种可促进ADSCs成骨分化的交联壳聚糖凝胶，该水凝胶的疏松多孔结构增强了细胞与基质的相互作用，增加了氧气和营养物质的运输，从而促进细胞增殖。2019年，Pal等[17]研制了负载有人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogentic protein-2，rhBMP-2）和强力霉素的胶原-弹性蛋白样多肽（elastin-like polypeptide，ELP）的骨再生水凝胶，ADSCs在其中成功附着和增殖，碱性磷酸酶和骨钙素等成骨标记物大量表达，同时负载的强力霉素也表现出对多种细菌的抗性，展示了药物负载胶原-ELP水凝胶在抗细菌感染和促进引导骨再生方面良好的应用前景。并不是所有水凝胶支架都需要在成骨诱导剂作用下促进ADSCs的成骨分化，例如，在2015年，Lyu等[18]发现自支撑石墨烯水凝胶（self-sustaining graphene hydrogel，SGH）膜能单独刺激ADSCs的成骨分化，而这种良好的骨诱导性能与其独特的纳米结构、较强的细胞黏附性、合理的表面亲水性和高蛋白吸收等优异的物理性能密切相关。

4 软骨组织工程

在软骨分化的早期，HA是间质中一种关键的糖胺聚糖，在软骨生物力学中起着重要作用，HA能提高滑膜液的黏度和润滑性能。之前的研究结果表明，HA作为微环境因子可促进ADSCs的细胞聚集和软骨分化，最终促进透明软骨基质的形成[19]。Wang等[20]合成HA改性热敏聚（N-异丙基丙烯酰胺）[HApoly（N-isopropylacrylamide）-CL，HA-PNIPAAm-CL]水凝胶，增强了ADSCs的细胞相容性和软骨形成能力，成功为以ADSCs为基础的关节软骨组织工程提供了软骨诱导的微环境。Morrison等[21]将ADSCs与软骨细胞在透明质酸-胶原水凝胶中共培养，并将其置于3D打印的聚己内酯支架孔隙中，短期内成功诱导了软骨产生。ADSCs和软骨细胞共培养、水凝胶结合3D打印的生物可吸收支架，减小了传统软骨组织工程方法对细胞长期体外培养或外源性生长因子暴露的限制，是一次良好的尝试。Bhattacharjee等[22]开发出以羊膜（amnia，AM）组织为基础的可注射水凝胶，发现其不仅能支持支持ADSCs生存和增殖，还能与ADSCs协同发挥抗炎和软骨保护作用，展示了两者联合在治疗骨关节炎（osteoarthritis，OA）方面的潜力。

5 肌组织工程

骨骼肌损伤及萎缩是常见的肌肉组织疾病。尽管骨骼肌具有一定的再生能力，但仍有某些因素阻止其正常的修复过程，最终导致肌肉萎缩、功能丧失。干细胞疗法近年来已成为治疗此类疾病的热点方法[23]。2015年，Forcales[24]回顾性分析了ADSCs在肌肉再生中的应用，指出了它在肌肉组织工程中的广泛前景。在针对骨骼肌等一些较厚组织的组织工程中，主要限制因素是血管化。Kim等[26]将ADSCs与体内呈凝胶态的甲氧基聚乙二醇-聚己内酯[monomethoxyl poly（ethylene glycol）-b-poly（εcaprolactone），MPEG-PCL]结合作为肌肉再生基质，然后再加入VEGF，形成的水凝胶体系不仅增强了血管生成功能，而且提供了充足的营养物质，保证了细胞的活力和肌肉组织的再生。Hwang等[25]提出了一种由人脂肪干细胞（h-ADSCs）、碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）、明胶-聚乙二醇-酪胺（gelatinpolyethylene glycol-tyramine，GPT）构成的水凝胶体系，并证明了其在促进肌肉再生过程中的协同作用。虽然单独使用ADSCs可在一定程度上促进肌肉愈合，但将ADSCs与水凝胶和生物活性物质结合后，所构成的体系表现出了更显著的作用，包括增强新生肌肉组织的收缩力、增加血管生成以及减少局部纤维化。这些例子表明，包裹在水凝胶中的ADSCs是促进肌肉再生的一种有效的治疗方式。随着水凝胶设计的改进，这些组合系统可以不断改善优化，从而在肌肉组织工程中得到更广泛的应用。

6 心脏组织工程

心肌梗死对心脏的损害是不可逆转的，只有通过组织再生才能完全治愈。ADSCs是心脏组织再生的良好选择。可注射的纤维蛋白胶、基质凝胶、胶原、海藻酸钠凝胶，以及可注射的生物聚合物和自组装肽是心脏治疗常用的注射材料，这些材料有时也与ADSCs联用。例如，Wang等[27]用壳聚糖水凝胶将携带荧光素酶和Fluc基因-单聚红色荧光蛋白（Fluc-monomeric red fluorescent protein，Fluc-MRFP）双融合报告基因的棕色脂肪干细胞（brown adiposederived stem cells，BADSCs）移植到梗死大鼠心脏内，体内纵向生物发光成像和组织学染色结果显示，壳聚糖能提高移植BADSCs的存活率，并显著提高BADSCs向心肌细胞的分化率。此外，壳聚糖水凝胶给药的BADSCs可防止基质重塑，增加血管生成，保护心脏。该结果提示，以壳聚糖水凝胶和BADSCs为基础的可注射心肌组织工程是一种有效的心肌再生策略。内源性和外源性硫化氢（H2S）已经被证明对心血管系统可以产生抗炎、线粒体功能保存、血管扩张和抗氧化应激等广泛的保护作用，而2-氨基吡啶-5-硫代甲酰胺（2-aminopyridine-5-thiocarboxamide，APTC）是临床试验中最常用的硫化氢供体药物之一，但其有水溶性差、清除率高和有毒性等缺点。心肌梗死后，心肌细胞间的电脉冲信号传导被阻断，而导电水凝胶可通过促进梗死区的电脉冲传导，恢复心脏的同步收缩和舒张，有利于心脏功能的恢复。Liang等[28]将APTC置入部分氧化的海藻酸钠（alginate-catechol，ALG-CHO）中，以模拟内源性H2S的缓慢持续释放，此外又进一步引入导电低聚物四苯胺和ADSCs，通过ALG-CHO与明胶之间的希夫碱反应，形成一种载有干细胞的导电H2S释放水凝胶。该水凝胶具有较强的黏附性，能稳定地锚定在潮湿和跳动的心脏上。实验结果表明，ADSC负载的导电H2S释放水凝胶能显著提高对心肌梗死的治疗效果，提供了一种很有前途的治疗策略。

7 神经组织工程

神经轴突断裂后无法恢复的特性限制了神经损伤的治疗效果[4]。ADSCs经表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）适当诱导后，可分化为神经细胞。提示ADSCs在干细胞治疗神经再生中具有较高的潜能。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）也可促进干细胞的存活和神经元分化。Burgers等[29]证明了NGF具有促进大鼠海绵状神经再生的作用。Kim[30]将ADSCs和神经生长因子-透明质酸水凝胶结合，成功改善了海绵状神经损伤大鼠的勃起功能。Dong等[31]制备出一种导电微孔水凝胶并将ADSCs接种于微孔中形成细胞球，经过电刺激（electrical stimulation，ES）之后，发现ADSCs的神经元性分化能力显著提高。总之，在精心设计的水凝胶支架帮助下，ADSCs有望在神经损伤和疾病的治疗中发挥更重要的作用。

8 其他组织工程

除上述几大领域外，研究者也将ADSCs联合水凝胶材料在其他组织工程中做出尝试。Wang等[32]开发出胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）固定的壳聚糖-透明质酸（CS-HA）水凝胶，并将此生物活性水凝胶联合ADSCs注入缺血损伤肢体后，成功促进了细胞基础上的血液灌注恢复和肌肉细胞再生。该研究是以血供丧失为主要病理生理特征的外周动脉疾病在组织工程治疗方案上的一次重要探索。De Moor等[33]利用3D生物打印技术将人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）、人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblast，HFF）和ADSCs共培养于水凝胶中，构建出具有良好生物相容性的自组织血管化微球体，这些微球体可以相互融合，为更大型的血管组织工程提供基础。Zhu等[34]发现Kartogenin（KGN）共轭水凝胶具有支持ADSCs分布和相关因子传递的潜力，并能促进其向髓核细胞的分化。Zhou[35]等制备了以genipin为交联剂的Ⅱ型胶原/硫酸软骨素复合水凝胶 状 ADSCs（typeⅡcollagen/chondroitin sulfate composite hydrogel-like ADSCs，CCSA）传递系统，应用于髓核退行性变的大鼠，发现大鼠的椎间盘高度、含水量、细胞外基质合成和结构均有部分恢复。上述两项研究结果表明，干细胞组织工程在治疗髓核退行性疾病方面的潜力。直到目前为止，国内外对结直肠组织工程的研究还很少。Denost[36]曾尝试制备一种纤维蛋白和壳聚糖组成的复合生物凝胶，负载ADSCs后植入猪体内的缺损结肠壁中，观察到了修补部位结肠壁平滑肌细胞的再生以及植入物整体良好的抗炎作用，首次验证了组织工程结肠替代术的可行性。

9 结 语

本综述中，总结了ADSCs联合水凝胶在组织工程方面的进展。尽管这是一个新兴领域，但近年来研究者已经做了大量的研究。研究者根据皮肤、骨、软骨、心脏等组织工程的不同要求，用物理、化学等方法对各种不同特点的水凝胶进行处理，通过加入抗生素、生长因子、多肽等小分子物质，对水凝胶材料的孔径、溶胀率、抗菌性能、力学性能、降解性能进行调整与修饰。修饰后的水凝胶不仅保证了与ADSCs有良好的结合性能，而且能促进ADSCs良好存活、增殖并发挥出定向分化、分泌多种生长因子等作用。除了传统的方法外，3D打印技术也被引入该领域并得到发展。3D打印技术极大地克服了由于细胞密度有限、接种位置不可控以及支架内组织分布不均匀等原因，难以有效再生高度复杂组织的障碍[37]。因此，ADSCs联合水凝胶在组织工程和细胞治疗方面具有无限的潜力。

然而，若要使ADSCs联合水凝胶材料在组织工程中的应用更加广泛和成熟，仍然面临着一些挑战。例如，目前的3D打印技术仅能利用ADSCs和水凝胶构建相对简单的器官，但形成像肝内胆管、肾小球之类的复杂器官仍需要更多的研究和探索。此外，水凝胶支架在体内分解前后，脂肪干细胞的长期命运需要进一步明确。最后，水凝胶的力学形态特征与接触材料后细胞产生行为之间的相互作用也需要进一步阐明。相信随着ADSCs联合水凝胶材料在生物医学和材料科学领域中研究的深入，其在组织工程中的应用前景将更加光明。

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