DNA辐射损伤检测技术的研究进展

杨航 张辉 胡南 丁德馨

南华大学铀矿冶生物技术国防重点学科实验室，衡阳421001；南华大学极贫铀资源绿色开发技术湖南省重点实验室，衡阳421001

0 引言

铀矿山、核电站以及放射医疗环境中存在电离辐射，人体长期接受电离辐射会损伤体内DNA，从而对健康造成严重威胁。研究结果表明，细胞DNA是电离辐射的主要靶点，电离辐射通过改变碱基或破坏糖-磷酸基来破坏DNA，将DNA碱基序列结构上的任何重大变化统称为DNA损伤。DNA辐射损伤检测技术的发展对评估生物体的受辐射损害程度、诊断辐射相关的疾病以及提供相应的辐射防护方法具有重大意义。对常用的DNA辐射损伤检测技术的原理及应用范围进行综述，有助于科研人员根据辐射样本的实际情况选择最佳检测方法。本文主要对常用的DNA辐射损伤检测方法的原理、功能及优缺点进行总结，并对其研究的未来发展方向提出了建议。

1 直接检测法

直接检测法主要是检测DNA结构或DNA碱基在辐射损伤前后理化性质的改变，如DNA链断裂、DNA碱基暴露、DNA碱基氧化等，常用技术包括琼脂糖凝胶电泳技术、色谱联用技术、毛细管电泳技术和酶联免疫吸附技术。

1.1 琼脂糖凝胶电泳技术

单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）是将细胞悬浮液与琼脂糖混合，在显微镜载玻片上形成薄薄的凝胶；然后使用裂解剂破坏细胞膜和核膜，提取组蛋白，破坏核小体结构，使DNA残留嵌入凝胶中；若DNA链发生断裂，其超螺旋结构将会变得松散，在电场作用下DNA片段向阳极迁移；经荧光染色后，可见形似彗星的特征性图像，故又称为彗星实验。DNA受损越严重，产生的断链越多，则彗星尾长增加，尾部荧光强度增强[1]。采用CASP软件分析彗星图像[2]，观察彗星头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、彗星全长、尾长、尾矩和Olive尾矩等指标，可对DNA损伤进行定量。

SCGE能敏感又快速地检测任何具核细胞的DNA链断裂程度，包括培养的哺乳动物细胞、动物或人的血细胞、动物的血液淋巴细胞、精子、分解的组织细胞核等，且检测过程中无需对细胞进行放射性同位素标记[1,3]。SCGE的实验特性使其可用于检测任何形式的DNA损伤情况，包括DNA单链断裂（single-strand breakage,SSB）、DNA双链断裂（doublestrand breakage,DSB）和DNA修复能力。且SCGE用于研究单细胞内的DNA断裂片段时，还可区分SSB与DSB。SCGE可检测人体内白细胞或淋巴细胞的DNA损伤，被广泛应用于医学研究[4]。体外实验中采用SCGE检测电离辐射诱导的DNA损伤，结果呈剂量-效应关系[5]，体现了SCGE在辐射生物剂量学测定中的应用潜力。长期以来，碱性彗星实验一直被用于DNA氧化损伤的定量，且常被用于研究抵制电离辐射诱导DNA损伤的保护剂[6]，检测DNA切除修复、DNA合成抑制链终止剂的作用。

SCGE的优势在于使用范围广泛[3]，适用于所有真核细胞，在检测DNA辐射损伤的同时可对细胞群体异质性进行评估，且与细胞群体中是否存在程序性细胞死亡无关。但由于涉及领域广泛，实验标准难以确定，加之影响体内和体外碱性彗星实验结果的因素很多，如凝胶中琼脂糖的浓度、酶处理时间、碱处理时间、电泳强度、DNA染色程度等[7]，甚至裂解步骤亦可能影响彗星分析的结果。

1.2 色谱联用技术

电离辐射过程中产生的羟基自由基可作为活性氧参与DNA的氧化损伤，将鸟嘌呤氧化成一系列稳定的碱基氧化产物，其中8-羟基-2′-脱氧鸟苷已被广泛认为是DNA氧化损伤的标志物[8]，采用色谱联用技术检测8-羟基-2′-脱氧鸟苷可用于评价DNA的损伤程度。

通过色谱法检测DNA氧化产物以确定DNA的辐射损伤[9]，选择的模型化合物可以是分离的核苷或短链寡核苷酸，经氧化损伤后，可先使用高效液相色谱分离得到分解产物，然后选择合适的光谱进行表征[10]。色谱技术还可与其他高灵敏度检测手段联合使用，8-羟基-2′-脱氧鸟苷检测研究最早采用的是高效液相色谱-电化学联用技术，是一种简易的检测方式[11]。使用直接气相色谱-质谱联用技术检测时常会导致碱基在正常人为操作下的氧化，而改进检测条件的气相色谱-质谱联用技术可用于检测DNA中稳定的碱基氧化物，并对其进行定量[12]。另外，高效液相色谱串联质谱法是一种将液相色谱与电喷雾质谱检测相结合的分析方法，可用于多种DNA碱基修饰的检测，评估受损DNA的碱基水平，如小牛胸腺DNA、大鼠肝脏DNA或尿液DNA样本中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷[13]。如今，高效液相色谱与电喷雾串联质谱联用是最强大的分析工具之一，提高了测量方式的灵敏度和特异性，此外联用的同位素稀释质谱技术可提高对检测物质定量的精准性[9]。

色谱-质谱联用技术结合了色谱技术显著的分离能力和质谱技术高特异性的分辨能力，可先将样品洗脱、分离得到纯化的碱基氧化产物，再用离子化技术进行质谱定量，大大提高检测效率与检测精度。色谱法与质谱法的多种结合方式中，以高效液相色谱与电喷雾串联质谱联用最为高效，其具有多重反应监测模式，与常规离子监测模式相比，进一步提高了检测的灵敏度。但其存在一些缺点，如仪器价格昂贵、维护成本高、样品前处理复杂、对操作技能的要求较高。

1.3 毛细管电泳技术

毛细管电泳技术是以毛细管为通道分离带电粒子，以高压直流电场为驱动力，根据物质间电泳分配和流速的不同实现组分的分离。DNA在电离辐射过程中产生的8-羟基-2′-脱氧鸟苷，在机体修复机制的作用下，从DNA链上脱落并经尿液排出体外[14]。使用毛细管电泳技术检测尿液中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷可评估DNA的损伤程度，为DNA损伤的定量提供了一种无创检测手段[15]。

1967年Hjertén[16]首先提出在细孔径管两端加压，使管壁中自由溶液进行区带电泳分离。通过优化区带电泳的运行电压、温度、缓冲溶液pH值等条件，8-羟基-2′-脱氧鸟苷的最低检测浓度可达0.1μmol/L[17]。而采用毛细管凝胶电泳技术可检测电离辐射细胞坏死后的DNA片段，是一种经典的DNA损伤检测方式[18]。毛细管电泳技术还可与其他检测手段联合使用，如高效毛细管电泳-紫外光谱联用技术可快速测定未经处理的尿液样品中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷含量，比直接毛细管电泳更具操作优势[19]。目前，毛细管电泳技术仍需进一步改进。通常提高毛细管电泳的在线富集技术，如场放大堆积[20]、等速电泳[21]等，可显著改善检测方法的灵敏度，甚至达到对痕量样品的富集与检测，。

毛细管电泳技术实际包含电泳技术、色谱技术及其交叉内容，它使样品分析检测量从微升水平进入纳升水平。毛细管电泳的优点包括高效、分析速度快、进样量少、自动化程度高、分析对象广泛、分辨率高等，是一种新型的生物分析方法。虽然该技术检测峰窄，选择性好，但灵敏度较差，故用于定量检测DNA损伤时会受到限制。

1.4 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术是酶免疫测定技术中的主要手段。其基本原理为将已知抗原或抗体结合于固相载体表面，保持其免疫活性；将抗原或抗体与特定酶连接成酶标抗原或酶标抗体；检测时，按相应顺序加入待检样品和酶标抗原或酶标抗体，使其与固相载体表面的抗原或抗体结合，洗涤；滴加底物溶液，底物可在酶的作用下使其所含的供氢体显色，最后通过颜色反应对待检样品中的抗原或抗体进行定量[22]。

目前，主要通过酶联免疫吸附检测试剂盒测定尿液和血清中的8-羟基-2′-脱氧鸟苷[23-24]来研究长期低剂量电离辐射对人体DNA的损伤程度。酶联免疫吸附技术的主要优点是无需昂贵设备、使用方便且无需对尿液进行预处理（但混浊样品需离心处理）。然而，酶联免疫吸附技术存在特异性问题，每个特定的核酸检测均需要一个特定的反应试剂盒，尚不能广泛应用。

2 间接检测法

生物细胞在应对电离辐射造成的DNA损伤时，会激活细胞的应激反应体系，以保证自身的正常生长水平。间接检测法主要检测机体响应过程中产生的标志性蛋白和一些参与损伤修复机制的基因的表达。间接检测法主要包括磷酸化组蛋白H2AX（phospho-histone H2AX，γ-H2AX）免疫检测和蛋白质印迹法（Western Blot）。

2.1 γ-H2AX免疫检测技术

细胞在电离辐射条件下形成的DSB会激活细胞DNA损伤应答机制，将H2AX磷酸化为γ-H2AX。γ-H2AX形成的核心聚集区，称为γ-H2AX灶点或DNA损伤灶点。使用γ-H2AX免疫细胞学分析技术量化γ-H2AX灶点数目，即可评价DSB形成的数量和位置，从而评估电离辐射对DNA的损伤程度[25]。

γ-H2AX的检测方法通常涉及免疫印迹法、流式细胞术和免疫染色法。免疫印迹法通常用于分析大量的细胞群或组织提取物，而简单细胞的分析则通过流式细胞术或免疫染色法（荧光显微镜）进行检测。流式细胞术可快速检测大量细胞中的γ-H2AX水平，评估不同细胞周期所有阶段的γ-H2AX信号强度，同时评价与其相关的其他蛋白[26]。研究结果发现，γ-H2AX信号强度与细胞中γ-H2AX灶点的数量及大小呈定量相关性[27]。当γ-H2AX灶点经特定的免疫荧光染色后可视化为荧光离散点，使用荧光显微镜检测离散的γ-H2AX灶点为DSB的定量提供了一种敏感、有效、高特异性的方法[28]。

免疫印迹法因样品需求量太大而很少用于临床研究[29]。流式细胞术的优势在于快速、可靠、检测细胞量大，但通常对γ-H2AX灶点的定量结果是相对的。相反，荧光显微镜可检测单个细胞中的单个灶点[30]，故特别适用于检测低灶点量的辐射损伤细胞。目前，关于流式细胞术和荧光显微镜对γ-H2AX的检测性能对比研究较为匮乏。此外，虽然一个DSB的发生与一个γ-H2AX灶点的形成相关，但两者关系仍需深入考究。事实上，在足够的低氧浓度下，共济失调毛细血管扩张突变（ataxia telangiectasiamutated,ATM）蛋白和DNA依赖蛋白激酶（两者统称为DNA损伤应答激酶）均可独立于其他蛋白的介导作用而被激活，因此这些激酶可不依赖于DSB的信号而自行磷酸化H2AX[31]，这在一定程度上限制了γ-H2AX检测法的应用。尽管如此，γ-H2AX检测法仍是目前检测DNA双链损伤最灵敏和有效的方法之一。

2.2 Western Blot

Western Blot是一种免疫检测蛋白质的方法，步骤包括蛋白质电泳、转膜、蛋白质的免疫检测[32]。先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，将其吸附至固相基质上；然后以固定的蛋白质作为抗原，与特异性抗体起免疫反应；再与酶标记的第二抗体进行反应，利用底物显色技术检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。电离辐射对DNA的损伤会激活DNA损伤修复机制，引起DNA损伤修复相关蛋白的含量和活化程度的改变，应用Western Blot检测DNA损伤相关蛋白的表达，可评价电离辐射对DNA的损伤程度。

Towbin等[33]首次提出了在电泳和非电泳条件下实现蛋白质从凝胶到膜的转移，使抗体这样的大分子可更好地靶向膜上的蛋白质，成为Western Blot的简单形态。随着不同蛋白转移方式的出现，Western Blot已广泛应用于DNA辐射损伤检测领域。电离辐射可引起细胞内部产生活性氧，导致DNA断裂，而核因子E2相关因子2是调控细胞氧化应激的核心转录因子，可增强抗氧化酶以及Ⅱ相解毒酶的表达[34]。Western Blot可检测核因子E2相关因子2及相关抗氧化基因的表达，从而反映电离辐射下DNA受损程度和活细胞的抗辐射能力。另一方面，ATM是一种在感应和传递DNA损伤信号、启动损伤DNA修复中起着重要作用的蛋白，其活化程度与DNA损伤程度存在依赖关系[35]，采用Western Blot检测ATM蛋白的表达可实现对DNA辐射损伤的检测。另外，利用Western Blot分析细胞衰老的相关基因p21、p16和RecQ解旋酶介导的基因组稳定性蛋白1（RMI1）的量变化，可评估电离辐射诱导的DNA损伤程度及DNA修复能力[36]。

Western Blot的优点是可广泛应用于低丰度蛋白的检测。在实际应用中，当辐射现场无法模拟与重建时，用Western Blot生物分析法评估人员的受照剂量具有很大优势，但目前仍存在一些不成熟的技术问题[37]，且Western Blot的操作步骤繁琐。

3 展 望

DNA辐射损伤检测技术的研究可为新型辐射生物剂量计的发明提供新的研究思路，也可为核辐射患者的早期分类与临床诊断提供新的研究方向。人们从对DNA辐射损伤的简单认识到发现DNA损伤的修复机制，相应地设计出了对DNA结构改变的检测方法和机体响应机制中基因蛋白的评估手段。

常用的DNA辐射损伤检测方法中，高效液相色谱与电喷雾串联质谱联用技术成为实验室检测手段的最佳选择，其可实现对损伤的精准定量。但在实际临床诊断中，通常存在不同类型的DNA辐射损伤，因此研究人员需要考虑生物调控的响应或修复机制，适当选择不同的检测技术联合使用。随着研究的进一步深入，越来越多高灵敏度和高特异性的新兴DNA辐射损伤检测技术将被开发出来，未来应集中于研究一种综合分析能力强大的DNA损伤检测手段，始终朝着简便、快捷、灵敏、稳定的方向发展。

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