高效液相色谱-原子荧光光谱法分析底泥孔隙水中形态砷

邵长伟，黄杰超，梁毓娜，林梵宇

(1. 山东省物化探勘查院，山东 济南 250013；2. 自然资源部 第三海洋研究所，福建 厦门 361005)

砷(As)是自然界的一种金属元素，低剂量的砷对人体来说是必须的，可参与蛋白质的代谢、影响血清碱性磷酸酶、刺激造血器官、抑制皮肤老化及提高人体免疫力. 但人体摄入量过多时，会造成砷中毒. 2017年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)将砷和无机砷化合物列为一类致癌物[1]. 据报道，全球有至少5 000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁[2]. 砷元素一般与碳、氧、铁、硫等元素结合，形成各种氧化态的有机物或者无机物[3]，主要有亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)、一甲基砷酸MMA、二甲基砷酸DMA. 目前已发现30余种形态的砷化合物[3]. 不同形态的砷化合物，其毒性差别较大，无机砷的毒性大于有机砷的毒性，无机砷中亚砷酸盐As(Ⅲ)的毒性又大于砷酸盐As(Ⅴ)的毒性. 不同形态的砷可在人体内相互转变，从而产生不同毒性[4]. 由于不同化学形态的砷元素在生物体内毒性差异明显，仅测定砷元素的总量不能有效反映其对人体的危害程度，因此对砷元素的化学形态进行分析和定量具有重要的现实意义[5].

目前，对不同形态的砷化合物进行分析的方法有多种，如高效液相色谱-原子荧光光谱法、原子荧光光谱法和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[6-8]. 原子荧光光谱法测定砷已发展的较成熟，稳定性好，灵敏度高，但是对砷元素不同形态的测定，还是需要借助色谱分离才能完成. 电感耦合等离子体质谱法作为一种新兴的痕量分析技术，具有高效快速、灵敏度和准确度较高的优点[9]，但其仪器价格昂贵，维护成本高且对使用人员的要求也较为严格. 高效液相色谱-原子荧光光谱法的仪器价格低、灵敏度高，且可以在一定程度上消除来自样品的化学和背景光谱干扰[10]. 目前对形态砷的研究报道主要集中在水产品，底泥孔隙水中砷的形态研究报道较少，原因是底泥孔隙水的背景较为复杂，浓度低，形态不稳定，因此尚未有成熟的测定底泥孔隙水中形态砷的方法. 本文对高效液相色谱-原子荧光光谱法中流动相的pH、光电倍增管负高压、空心阴极灯电流、盐酸体积分数、硼氢化钾浓度等参数进行了优化，确定了测定不同形态砷的最佳条件，并将该方法应用于底泥孔隙水实际样品的测试. 对底泥孔隙水中4种形态砷的测试结果发现，底泥孔隙水中砷元素以三价无机砷As(Ⅲ)为主，这与高俊海等[11]在此前研究中对底泥孔隙水中形态砷的分析结果相符，即不受环境污染的孔隙水中是没有其他价态砷元素的检出. 经本研究对不同形态砷检测的条件优化后，方法检出限优于李艳苹等[12]液相色谱-原子荧光联用测定海水中无机和有机形态砷的结果. 试验结果表明，在本文的优化条件下，有利于检测底泥间隙水中较低浓度的形态砷，为开展环境污染检测及底泥间隙水中形态砷的迁移转化提供重要手段.

1 试验部分

1. 1 仪器与试剂

BAF-2000四通道原子荧光光度计(北京宝德仪器有限公司)；砷空心阴极灯；BSA-100高效液相色谱泵(配自动进样阀，北京宝德仪器有限公司)；KQ5200DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Elga FlexⅡ超纯水仪(威立雅水处理技术上海有限公司).

气体：氩气(99.999%)；试剂：硼氢化钾(KBH4)、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、甲酸(HCOOH)、磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)，均为分析纯；砷标准物质：亚砷酸盐(GBW08666，以砷计含量：75.7 μg/g)；砷酸盐(GBW08667，以砷计含量：17.5 μg/g)；一甲基砷(GBW08668，以砷计含量：25.1 μg/g)；二甲基砷(GBW08669，以砷计含量：52.9 μg/g)；以上试剂均采购于中国计量科学研究院；试验用水为去离子水(18.2 MΩ·cm).

1. 2 溶液配制

硼氢化钾溶液(30 g/L)：称取30 g硼氢化钾，使用5 g/L 氢氧化钠溶液溶解并定容至1 000 mL，避光保存，现用现配.

流动相：称取1.98 g磷酸氢二铵溶于1 000 mL超纯水中，使用10%甲酸溶液调节pH至6.00，经0.45 μm水系滤膜过滤后，于超声水浴中超声脱气30 min备用.

标准溶液的配制：分别准确移取砷酸根标准溶液133 μL、亚砷酸根标准溶液574 μL、一甲基砷标准溶液399 μL、二甲基砷标准溶液190 μL至10 mL容量瓶，使用流动相定容至刻度，配制4种形态砷的混合标准储备溶液，其质量浓度均为1 000 μg/L. 分别移取混合标准储备液50、100、200、500、1 000 μL至10 mL容量瓶，使用流动相定容至刻度，配制4种形态砷的混合标准工作溶液，其质量浓度分别为5、10、20、50、100 μg/L.

1. 3 仪器条件

1. 3. 1 色谱参数

色谱柱：Hamilton PRP-X100型(10 μm，250×4.1 mm)；保护柱：Agela SH-100型(4.6×2.1 mm)；流动相：1.98 g/L (NH4)2HPO4；流速：1 mL/min；进样体积：100 μL；柱温：25 ℃.

1. 3. 2 原子荧光光谱参数

还原剂：3% KBH4+ 0.5% NaOH；载流：7% HCl；原子化器温度：200 ℃；原子化器高度：8 cm；主阴极电流：40 mA；辅阴极电流：40 mA；光电倍增管负高压270 V；载气流量：400 mL/min；屏蔽气流量：800 mL/min.

2 结果与讨论

2. 1 流动相pH值的影响

流动相的pH值对砷的4种形态分离程度有较大影响. 为探究其影响程度，使用体积分数为10%的甲酸溶液，调至磷酸氢二铵流动相(1.98 g/L)的pH值分别为5.00、6.00、7.00、7.80，其中pH为7.80的缓冲溶液不添加10%甲酸溶液，观察其对砷的4种形态的分离程度，结果如图1所示. 由图1可知，pH为7.80时，As(Ⅲ)、DMA、MMA三种形态砷分离程度不够，尤其是DMA、MMA两种形态砷出现叠加. pH为7.00时，DMA、MMA两种形态砷出现叠加，未分离. pH为6.00时，4种形态砷的分离程度良好，峰型完整. pH为5.00时，MMA的出峰时间后移，较前三组相对靠后，峰型完整，但As(Ⅲ)和DMA的分离程度不够，在As(Ⅲ)的出峰末端和DMA的出峰前端，出现稍微叠加. 故本试验的流动相采用pH为6.00的磷酸氢二铵缓冲溶液.

图1 流动相pH值对砷的4种形态分离程度的影响Fig. 1 Effect of pH of mobile phase on separation degree of four forms of arsenic

2. 2 光电倍增管负高压的影响

光电倍增管负高压的高低会直接影响形态砷检测的灵敏度. 随着负高压的增大，检测的灵敏度增高，4种形态砷的峰面积增大，但是过高的负高压会影响光电倍增管的寿命，同时负高压增高会导致噪声变大，从而影响形态砷的检出限. 本试验探究不同负高压值(240、250、260、270、280、290 V)对形态砷信噪比的影响，结果如图2所示. 由图2可知，随着负高压的升高，信噪比先增大后减小，在负高压等于270 V时信噪比最大，对测定影响最小. 考虑到负高压过大会对光电倍增管产生损耗，故本文最终选择光电倍增管负高压为270 V.

图2 不同负高压对信噪比的影响Fig. 2 Effect of different negative high voltages on signal-to-noise ratio

2. 3 空心阴极灯电流的影响

空心阴极灯电流的大小，决定了激发光源的强弱. 空心阴极灯灯电流越大则激发光源越强，灵敏度越高，但灯电流过大会导致灯的使用寿命降低. 本文探究不同灯电流值(40、50、60、70、80、90、100、110 mA)对形态砷信噪比的影响，结果如图3所示. 由图3可知，随着灯电流的升高，信噪比先增大后减小，在灯电流等于80 mA时信噪比最大. 此外过高灯电流会降低空心阴极灯的使用寿命，故选择灯电流为80 mA.

图3 不同灯电流对信噪比的影响Fig. 3 Effect of different lamp currents on signal-to-noise ratio

图4 不同盐酸体积分数对各形态峰面积的影响Fig. 4 Effect of different hydrochloric acid volume fractions on peak area of various forms

2. 4 载流盐酸浓度的影响

载流盐酸的浓度对各个砷的形态所产生的峰面积有一定的影响，分别配制7组不同体积分数的盐酸溶液(4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)对砷混合标准溶液进行测定，研究不同盐酸体积分数对形态砷峰面积的影响，结果如图4所示. 由图4可见，随着盐酸体积分数的增加，形态砷的峰面积先增加后减小. 当盐酸体积分数为7%时，4种形态砷的峰面积达到最高值，再增加盐酸体积分数，峰面积出现下降趋势. 因此，本文选用7%的盐酸溶液作为载流.

2. 5 硼氢化钾浓度的影响

不同形态的砷在硼氢化钾-盐酸体系下会反应生成氢化物，硼氢化钾的浓度很大程度上会影响氢化物的产生. 配制质量浓度不同的硼氢化钾溶液(15、20、25、30、35 g/L)，对砷混合标准溶液进行测定，研究不同质量浓度的硼氢化钾溶液对形态砷峰面积的影响. 试验发现，较低浓度的硼氢化钾溶液在盐酸体系中氢化物的生成率低，导致各组分的峰面积偏低，随着硼氢化钾浓度的升高，砷氢化物的生成率升高，各组分的峰面积升高. 由图5可知，随着硼氢化钾浓度的增加，形态砷的峰面积先增加后减小，当硼氢化钾的质量浓度达到30 g/L时，各组分的峰面积最大. 但过高的硼氢化钾浓度会导致产生过量的氢气，在一定程度上稀释由各组分形成的原子蒸气，从而使各组分的峰面积降低. 因此，本文采用硼氢化钾的质量浓度为30 g/L.

图5 不同硼氢化钾浓度对各形态峰面积的影响Fig. 5 Effect of different potassium borohydride concentrations on peak area of various forms

2. 6 4种形态砷标准样品的谱图

在优化的试验条件下，将砷标准样品通过色谱柱进行分离后，先与载流混合再与还原剂混合，发生氢化反应，通过原子荧光仪对4种形态砷产生的原子蒸气进行检测. 本文采用PRP-X100阴离子交换柱对砷的形态进行分离，选用pH值为6.00的磷酸氢二铵溶液作为流动相，流速1 mL/min，对质量浓度为50 μg/L的溶液进行测定，色谱峰如图6所示. 由图6可见，在13 min之内，As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)依次出峰，实现完全分离，峰型较好，保留时间分别为2.767、3.850、5.283、12.150 min.

图6 优化条件下的标准谱图Fig. 6 Standard spectrum under optimized conditions

2. 7 4种形态砷的标准曲线、检出限及精密度

在优化条件下对形态砷标准混合溶液进行分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线. 以3倍信噪比(S/N≥3)计算得出方法的检出限. 取10 μg/L的4种形态砷混合标准溶液，分别进样7次，计算相对标准偏差(RSD)，结果如表1所列，当4种形态砷混合标准溶液的质量浓度在5～100 μg/L之间时，该方法标准曲线线性关系良好，相关系数均大于0.999 1，检出限在0.22～0.43 μg/L之间，RSD在0.92%～3.94%之间.

表1 优化试验条件下形态砷标准混合溶液的标准曲线、检出限及精密度Table 1 Standard curves, detection limits and precisions of arsenic standard mixed solution under optimized experimental conditions

2. 8 底泥孔隙水准确度加标回收分析

取三份底泥孔隙水样品，对其形态砷含量进行测定，在三份样品中分别加入5 μg/L的形态砷混合标准溶液做加标回收试验，结果如表2所列. As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)的加标回收率分别在89.0%～96.4%、90.6%～95.6%、95.0～102.4%、94.2%～103.0%之间，表明方法有很好的准确度，用此方法测砷的4种形态结果可靠.

表2 底泥孔隙水样品的加标回收率(n=3)Table 2 Recoveries of sediment interstitial water samples

2. 9 底泥孔隙水样品分析

使用该方法检测来自南海海域的18个底泥孔隙水样品中的形态砷(结果如表3所列)，其中有14个样品检测到As(Ⅲ)， DMA、MMA及As(Ⅴ)这三种形态砷含量低于检出限，表明底泥孔隙水样品中的砷主要以无机砷中的As(Ⅲ)存在，其他三种形态砷的含量极低.

表3 底泥孔隙水样品中4种形态砷的测定结果Table 3 Determination of four forms of arsenic in sediment interstitial waters

3 结论

(1)本文优化了液相色谱-原子荧光光谱联用技术分析不同形态砷的测试条件，试验结果表明，当流动相的pH值为6.00、光电倍增管负高压为270 V、空心阴极灯电流为80 mA、载流体积分数为7%盐酸溶液、还原剂质量浓度为30 g/L硼氢化钾时，各形态砷的分离程度最好且各形态砷的峰面积最大. 在优化的试验条件下，测定结果显示不同浓度的4种形态砷标准溶液的标准曲线线性良好，4种形态砷的精密度、检出限及加标回收率均满足分析方法的质量要求.

(2)由底泥孔隙水中4种形态砷的测试结果发现，底泥孔隙水中砷元素以三价无机砷As(Ⅲ)为主，表明液相色谱-原子荧光光谱联用技术可以用于底泥孔隙水样品中不同形态砷的测试.