产乳酸芽孢杆菌DU-106益生特性的研究

2021-04-02赖玉健陈素梅罗珮桓

中国酿造 2021年3期

赖玉健，陈素梅，罗珮桓，黎攀，杜冰*

（华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

乳酸作为世界公认三大有机酸之一，在食品、医药、化妆品、农业上都有着十分广泛的应用，也是生物体机体代谢的重要中间产物，具有重要的生理功效[1-2]。菌株DU-106是一株从内蒙古发酵酸奶中分离出来新菌种，经过鉴定属于芽孢杆菌属（Bacillussp.）[3]，是蜡样芽孢杆菌种的一个亚种，具有抗逆性强、耐高温、耐酸、易储存等芽孢杆菌所具备的独特性，同时又具有乳酸菌中产生乳酸的特性，在培养基发酵过程中能产生6.3 g/kg的乳酸，具备较大的潜在应用价值。在前期的应用研究中，发现菌株DU-106具有良好的发酵特性，目前已经应用在果酒[4-5]、饮料[6]、中草药[7-8]的在的发酵上。同时，在对其生理活性的研究中，发现其在降血脂、抗腹泻方面有良好的效果，在提高免疫力方面也表现优异。本研究以产乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106为研究对象，探讨其是否具备益生菌在体内存活的能力，并与凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BC30及鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R11耐受性进行比较，对乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106的深层次开发利用颇为重要，不仅可以提高其功能在生产应用中发挥的效能，还便于开发出新的用途。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106：本实验室保藏菌种；凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BC30：美国杜邦公司；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）R11：法国拉曼公司。

1.1.2 化学试剂

酵母膏、蛋白胨（均为生化试剂）：上海哈灵生物科技有限公司；人工胃液、人工肠液：北京雷根生物技术有限公司；猪胆盐（生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司；其他均为广州化学分析厂分析纯试剂。

1.1.3 培养基

MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司。

发酵培养基：酵母膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，硫酸镁1 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸锰10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

PHS-25型pH计：上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1D型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-150B微机生化培养箱：上海悦丰仪器仪表有限公司；UV-1200紫外可见分光光度计：广州沪瑞明仪器有限公司；Agilent 6890N高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株DU-106生长曲线及产酸曲线的绘制

将菌株DU-106接种至发酵培养基中，最终接种量为107个/mL，在37 ℃、120 r/min的摇床中进行培养，得到菌株DU-106发酵液，隔4 h测一次吸光度值（OD600nm值）、pH和总酸[9]，分别绘制菌株DU-106的生长曲线及产酸曲线。

1.3.2 分析检测

（1）总酸的测定

取发酵液样品4 mL，加入1%的酚酞2～3滴，用浓度为0.100 mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定至出现颜色变化，并保持颜色不变色30 s，记录氢氧化钠滴定量，再用公式算出总酸的量[10]。总酸计算公式如下：

式中：x为总酸含量，mg/mL；C为氢氧化钠溶液的浓度，mol/L；V1为滴定NaOH的体积，mL；V2为滴定空白的体积，mL；m为取的菌液的体积，mL；0.09为乳酸换算系数。

（2）菌株存活率

取不同时间的发酵培养基样品1 mL加入发酵培养基中，在37 ℃条件下恒温培养24 h后，用平板计数法测数菌落数，并记录。菌株存活率计算公式如下：

式中：N0为0 h活菌数，CFU/mL；Nt为t（t=1.0或3.0）h活菌数，CFU/mL。

（3）有机酸测定

取37 ℃、120 r/min的摇床中发酵24 h后的DU-106发酵液，3 600 r/min离心10 min，取上清液，采用高效液相色谱法（HPLC）测定其有机酸含量。HPLC色谱条件：色谱柱：AtlantisRR T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A相为甲醇，B相为KH2PO4，用磷酸调pH至2.7；流速为1 mL/min，检测器为光电二极管阵列检测器；检测波长为210 nm；进样量为10 μL。

1.3.3 菌株DU-106生长耐受性试验

（1）胆盐的耐受性

以5%接种量接种至含有质量分数为0.3%、0.6%、0.9%猪胆盐的培养基中，以不加猪胆盐的培养基为空白对照，在37 ℃、120 r/min的摇床中进行培养4 h，用平板计数法测定菌落总数。

（2）模拟液的耐受性

在培养基中添加适量模拟胃液，分别接入菌株DU-106、BC30、R11，在37 ℃、120 r/min的摇床中进行培养4 h后，取5 mL样品接入肠液中，以不加模拟液的培养基为空白对照，培养24 h后，测定菌落总数。

（3）pH耐受性

以5%接种量将菌株DU-106、BC30、R11菌种分别加入pH值为2、3、4、5的培养基中，在37 ℃、120 r/min条件下振荡培养1 h、3 h后，分别测定菌落总数。

1.3.4 菌株DU-106抗生素敏感性试验

采用微量肉汤稀释法[11]，在96孔板里，1～10孔抗菌药物青霉素G、庆大霉素、克林霉素、头孢曲松、加替沙星、环丙沙星、链霉素、四环素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢吡肟、利福平、红霉素、氯霉素、诺氟沙星、甲氧氨苄嘧啶/磺胺甲基异恶唑、头孢噻肟、亚胺培南、万古霉素、磷霉素、硫酸卡那霉素、氨苄西林、蔡啶酮酸等24种，2倍稀释，第11孔加菌不加药作为生长对照，第12孔两者都不加作为空白对照。每种抗菌药物做两个重复。将用直接菌悬液法制备浓度为0.5麦氏（相当于1.5×108CFU/mL）的菌悬液，经MH肉汤（Mueller-Hinton Broth）培养基1∶20稀释后加入1～11孔。密封后置35 ℃生化培养箱中，孵育48 h判断结果。第1孔至第10孔药物质量浓度分别为128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。

1.3.5 数据处理

利用SPSS version 22.0进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 菌株DU-106的生长曲线和产酸曲线

2.1.1 菌株DU-106的生长曲线

由图1可知，菌株DU-106的OD600nm值随发酵时间增加呈逐步上升的趋势，OD600nm值由0增加至2左右。发酵时间为0～12 h，OD600nm值几乎没有增加，这是由于菌株刚刚接种到培养基中，正在缓慢适应生长环境，不断地吸收营养物质来生长繁殖，这是菌株DU-106的生长迟缓期。发酵时间为12～36 h，OD600nm值急剧增加，这是由于菌株DU-106逐渐适应环境，经历指数增长阶段，不断地生长繁殖，这是菌株DU-106的对数生长期。发酵时间为36～48 h，OD600nm值增加相对缓慢，最后趋于稳定，这是因为菌株DU-106菌落数前期急剧增加，对营养物质的消耗造成营养物质缺乏、有害代谢产物积累[12]、pH值等条件不适宜，这是菌株DU-106的稳定期。发酵时间为48 h后，菌株DU-106生长不再增加，开始进入衰亡期。综上所述，菌株DU-106在0～12 h处于生长迟缓期，12～36 h处于对数生长期，36～48 h处于稳定期，48～60 h处于衰亡期。

图1 菌株DU-106的生长曲线Fig.1 Growth curve of strain DU-106

2.1.2 菌株DU-106的产酸曲线

菌株DU-106属于产乳酸芽孢杆菌，在适宜的生长条件下，能够产生乳酸，导致培养液pH降低和总酸升高，因此，可以通过pH和总酸的变化了解菌株DU-106的产酸情况[13]。

图2 菌株DU-106的产酸曲线Fig.2 Acid production curve of strain DU-106

由图2可知，总酸含量表现出先增加后平稳的趋势，进过36 h发酵，总酸由0增加至1.7 g/L；pH测定表现出先增加后降低再趋向平稳的趋势，pH由6.20上升至6.50，再降低至5.00并保持。0～8 h，总酸增加缓慢，pH值先上升，可能是因为菌株DU-106刚刚接种到MRS培养基中，其代谢系统需要适应新的环境，同时要合成酶、辅酶、其他代谢中间代谢产物等[14]，因此，0～8 h是DU-106的迟缓期。8～24 h，总酸急剧增加，pH急剧降低，可能是因为DU-106逐渐适应环境，从环境中获得营养物质，不断地生长繁殖，以及大量产酸。因此，8～24 h是菌株DU-106的对数生长期。24～36 h时总酸继续增加，但是增加的趋势较为缓慢，pH值变化相对缓和，可能进入菌群生长稳定期，但是由于生长空间有限，营养物质不断消耗、有害代谢产物积累、pH值等理化条件不适宜，导致菌落之间进行竞争式生长，不断有新菌产生，也有旧菌凋亡的阶段[15]。36 h后pH和总酸变化不大，表明菌落进入生长稳定期。

2.2 菌株DU-106生长耐受性

2.2.1 胆盐耐受性

图3 三组菌株经不同浓度的胆盐处理后的活菌数（A）和存活率（B）Fig.3 Viable count (A) and survival rate (B) of three groups of strains treated with different concentrations of bile salt

由图3A可知，菌株DU-106在经过0.3%、0.6%、0.9%浓度的胆盐处理后，活菌数分别为8.7×1010CFU/mL、7.0×1010CFU/mL、4.0×1010CFU/mL。由图3B可知，菌株DU-106在经过0.3%、0.6%、0.9%浓度的胆盐处理后，存活率分别为91.8%、73.9%、42.2%，与空白对照组（9.3×1010CFU/mL）相比，活菌数和存活率均有所下降，而且随着胆盐浓度升高，耐受性显著降低，0.3%胆盐浓度下存活率能超过90%，而在0.9%胆盐浓度下存活率仅有42.2%。同时，对比菌株R11在经过0.3%、0.6%、0.9%浓度的胆盐处理后，活菌数分别为8.5×1010CFU/mL、7.0×1010CFU/mL、未检出，存活率分别为91.8%、73.9%、0，与空白对照组（9.0×1010CFU/mL）相比，活菌数和存活率均有所下降，特别明显的是，菌株R11对0.9%浓度的胆盐不能耐受。而对于凝结芽孢杆菌BC30来说，经过0.3%、0.6%、0.9%浓度的胆盐处理后，活菌数分别为9.2×1010CFU/mL、7.9×1010CFU/mL、5.7×1010CFU/mL，存活率分别为98.9%、84.9%、61.3%，与空白对照组（9.3×1010CFU/mL）相比，在0.3%浓度的胆盐下活菌数和存活率几乎没有变化，而在0.6%和0.9%浓度下则降低，而且随着胆盐浓度升高，耐受性显著降低。众所周知，芽孢杆菌的抗逆性是比较好的，所以菌株BC30对0.3%浓度的胆盐的耐受性也是最好的，存活率达到98.9%。而菌株DU-106组在0.3%浓度下也能保持90%以上的存活率，说明菌株DU-106对0.3%浓度的胆盐具有良好的耐受性。

2.2.2 模拟胃肠液耐受性

经过4 h模拟胃液和肠液处理后，菌株DU-106和其他两株对比菌种的活菌数和存活率见图4。

图4 三组菌株经模拟胃液和肠液处理后的活菌数（A）和存活率（B）Fig.4 Viable count (A) and survival rate (B) of three groups of strains treated with simulated gastric juice and intestinal juice

由图4A可知，菌株DU-106、R11、BC30在经胃液处理4 h之后，活菌数均降低，分别由9 CFU/mL降至5.97×1010CFU/mL、4.65×1010CFU/mL、6.07×1010CFU/mL，其中，菌株R11降低幅度最大，菌株DU-106和BC30的活菌数变化不大，均能保持在6×1010CFU/mL左右。再经过肠液处理24 h后测得活菌数有所增加，分别为6.43×1010CFU/mL、6.02×1010CFU/mL、6.23×1010CFU/mL，其中菌株DU-106组经肠液处理后的活菌数要略优于其他两组对比菌株，但都比空白对照组（即MRS培养基组）的活菌数要低。由图4B可知，菌株DU-106经过胃液和肠液处理后仍然能保持66.5%和71.7%的存活率，菌株R11经过胃液和肠液处理后的存活率仅为52.48%和67.95%，菌株BC30进过胃液和肠液处理后的存活率也能达到68.31%和70%。因此，结果表明菌株DU-106对胃液和肠液具有一定的耐受性，在胃液和肠液中能保持良好的存活率，耐受性和存活率相比对比菌株均优异。

2.2.3 酸耐受性

图5 菌株DU-106经过不同pH值处理1 h（A）和3 h（B）后活菌数Fig.5 Viable count of strain DU-106 treated with different pH for 1 h (A) and 3 h (B)

由图5可知，菌株经过不同pH值的环境处理对活菌数的影响不一样，酸性越强，则存活率越低，酸性越弱，存活率越高。由图5A可知，经过1 h处理，在pH值为2、3、4、5中的活菌数分别为6.0×1010CFU/mL、8.0×1010CFU/mL、9.9×1010CFU/mL、11.6×1010CFU/mL，而空白对照的活菌数为10.2×1010CFU/mL，存活率分别为58.8%、78.4%、97.1%和113.7%。由图5B可知，经过3h处理后，在pH值为2、3、4、5中的活菌数分别为8.7×1010CFU/mL、10.0×1010CFU/mL、11.5×1010CFU/mL、11.7×1010CFU/mL，存活率分别为85.3%、98.0%、112.7%和114.7%。由于在pH值较强的环境中仍然存活，所以使得菌株DU-106在经过1 h和3 h处理后的活菌数超过空白对照组，存活率超过100%。结果表明，菌株DU-106在pH值为2的强酸性环境中仍然能保持58%以上的存活率，说明菌株DU-106对强酸环境也具有良好的耐受性。

2.2.4 菌株DU-106抗生素敏感性

试验所用抗菌药物对菌株DU-106的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）见表1。

表1 抗生素对菌株DU-106的最小抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentration of antibiotics against strain DU-106

由表1可知，菌株DU106敏感的抗菌药物有庆大霉素、四环素、红霉素、克林霉素、万古霉素、诺氟沙星、环丙沙星、加替沙星、克林霉素、磷霉素、亚胺培南11种。处于中介的抗菌药物有链霉素、硫酸卡那霉素、萘啶酮酸、氯霉素4种。耐药的抗菌药物有青霉素G、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、甲氧氨苄嘧啶/磺胺甲基异恶唑9种。菌株DU-106对常用的部分抗生素具有敏感性，在后续的研发和服用中，应尽量避免与敏感性抗生素共同食用。

2.3 菌株DU-106产有机酸结果

菌株DU-106代谢产有机酸的HPLC检测结果见表2。

表2 菌株DU-106代谢产有机酸种类及含量Table 2 Types and contents of organic acids produced by strain DU-106 metabolism

由表2可知，菌株DU-106代谢产生的有机酸种类有乳酸、草酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸等有机酸。其中，乳酸含量最高，达6.3 g/kg，其他种类的有机酸含量为草酸0.25～2.7 g/kg。结果表明，菌株DU-106发酵过程中能产生较多的乳酸，具备良好的乳酸发酵特性。

3 讨论

菌株DU-106属于产乳酸芽孢杆菌属，其特点为能够发酵糖类产生大量的乳酸，因此，培养基中的糖类、无机盐等成分对其的生长至关重要。当菌株DU-106拥有适宜生长条件之后，其产酸活动随着菌的生长繁殖也增加，当培养基中的营养物质逐渐被菌株DU-106消耗完毕，以及菌株DU-106的菌数逐渐增加，菌株DU-106的生长和产酸活动也就减少，乳酸积累接近饱和状态，生长进入衰亡期[16]。因此，该菌株在发酵产乳酸时，如果要获得较高的乳酸产量，需要及时补充营养物质。

对于益生菌来说，必须进入人体的胃肠道才能发挥其有益功能，从口腔到人体肠道过程中，人体的胃部是益生菌的必经之路[17]，胃液pH的大小由饮食结构不同有所差异，通常在3左右[18]，空腹或食用酸性食物时，胃酸pH可达1.5。胆盐是人体内一道重要的消化液，对人体消化吸收营养有着重要的作用。然而，益生菌要达到人体小肠内发挥功效，需要拥有耐受高浓度胆盐的能力[19]。人体小肠中胆酸盐含量在0.03%～0.30%范围内波动[20]，而益生菌经摄入后，经过胃和小肠，最终才能定植。菌株DU106在经过模拟胃肠道液和胆盐处理数小时后，仍能保持较高的存活率，说明其具备良好的抗逆性，能够经受住人体胃肠道中的强酸性环境。