外泌体在冠心病治疗中应用的研究新进展

尹亮，史博群，刘德敏，谷国强

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAHD，冠心病）是冠状动脉（冠脉）血管发生动脉粥样硬化（AS）而引起血管狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，是冠脉疾病中的一种常见疾病。全面了解其发生发展的病理生理学机制，对于改善冠心病患者的预后至关重要[1]。

外泌体是细胞外囊泡的一个亚群，其内容物的变化可能提示生理或病理变化，被临床诊断学广泛视为关键生物标志物。本文旨在从外泌体的发生、分泌和摄取为出发点，就其在冠心病的诊断和治疗等方面的应用进行综述。

1 外泌体的早期发现

外泌体生物形成机制十分复杂。但随着相关分离技术和检测水平的不断提升，目前对外泌体的研究已成为各学科的热点问题[2]。小细胞囊泡的描述最早出现于1960年，Bonucci和Anderson观察到软骨细胞分泌直径约100 nm的小囊泡。同时Wolf首先报道了血小板能够释放细胞外囊泡（称为血小板尘），并且它们具有显著的促凝血作用。与外泌体相关的研究从1980年开始，Trams等第一次发现哺乳动物细胞可分泌两种大小的囊泡，一种是直径约40 nm的小囊泡，另一种是直径约500 nm的大囊泡。他们最终采用微囊泡描述更大的囊泡，而“外泌体”则被用于描述更小的囊泡[3]。

2 外泌体的生物发生、分泌和摄取

细胞外囊泡是由不同类型细胞释放的一类膜结合相关的细胞器，包含许多生物活性分子，如蛋白质、脂质和核酸等。这些囊泡根据大小、生成部位和含量的不同，分为凋亡体、微囊泡和外泌体[4]。外泌体形成相对复杂，细胞膜向内出芽形成早期内体，随后内泌体膜再次向内萌发形成晚期内泌体，晚期内泌体内含各种腔内囊泡，将其命名为多囊泡体[5]。细胞内的多囊泡体通过与溶酶体直接融合后降解，也可通过与细胞膜融合向细胞外释放腔内囊泡。这些由细胞膜向外释放的腔内囊泡被称为外泌体[6]（图1）。外泌体又称小细胞外囊泡，是由磷脂包被的结构，通常直径在30～150 nm之间，在透射电镜下呈杯状，并且几乎所有细胞都能释放外泌体[4,7]。外泌体包含多种遗传信息，如蛋白质、microRNA（miRNA）和mRNA。外泌体富含miRNA，其通过旁分泌或内分泌作用，参与了许多基本的细胞功能（包括细胞增殖、凋亡、细胞因子的产生、免疫调节等）。且与血浆中的miRNA相比，外泌体miRNA在生物体液中高度稳定，外泌体的脂质双层可保护miRNA免受体液的酶促降解，导致相对较长时间且稳定的表达[7]。外泌体具有体积小，免疫原性低等生物学特点，可作为冠心病潜在的生物标志物。

图1 外泌体生物发生、分泌、摄取过程

多项研究发现小G蛋白（GTPase）、RAL-1（与Ras相关的GTPase同源物）、雷帕霉素复合物的机制靶点1（mTORC1）等几个关键分子参与细胞膜融合以及外泌体的释放[4,8]。这些转运分子将多囊泡体向质膜转运并与参与质膜融合，还参与外泌体的分泌。其中Rab家族中小GTPase成员在细胞内囊泡的转移中起重要作用，还涉及多囊泡体转运到质膜进行外泌体分泌的过程[8]。

已知的外泌体摄取机制包括：融合、结合和内吞作用。外泌体外膜可直接与受体细胞膜融合后，外泌体中的蛋白质、miRNA、mRNA会被释放到受体细胞的细胞质中，从而影响受体细胞的一系列功能[4]。不仅如此，外泌体与细胞外配体结合后，再与受体细胞结合，激活信号转导影响受体细胞功能。此外，内吞作用的机制差异很大，其中包括微胞作用、吞噬作用、小泡介导??的内吞作用、受体介导的内吞作用等[9,10]。Eguchi等[9]发现心肌细胞通过网格蛋白介导内吞作用来内化外泌体来源的miRNA，此过程在抗心肌细胞凋亡起到重要作用。

3 不同细胞来源外泌体与冠心病

众所周知，AS是一个多因素作用的慢性过程。随时间推移，动脉粥样斑块可导致管壁纤维化加重以及钙盐沉积。进展期动脉粥样斑块可侵犯动脉管腔，阻碍血流通过，导致组织缺血。当它影响心脏自身循环时可能会引起急性冠脉综合征（如心肌梗死）；也可导致慢性疾病（如稳定型心绞痛[11]）。可见冠心病的发病与AS密切相关。外泌体通过miRNA和其他介质参与心肌细胞的旁分泌和内分泌过程。干细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、脂肪细胞和血小板释放的外泌体为冠心病的诊断及治疗提供了有价值的生物学信息[5]。

3.1 间充质干细胞来源的外泌体 间充质干细胞具有多向分化的能力、良好的体外培养和操作特性、较强的免疫调节活性等优势，所以在医学领域引起了广泛关注[12]。研究表明，间充质干细胞虽不能直接取代受损组织，但可通过旁分泌效应发挥治疗作用，其中外泌体被认为是关键因子之一[13]。Teng等[14]发现间充质干细胞对受损心肌的保护作用主要依赖其促血管生成活性。在大鼠心肌梗死模型中，间充质干细胞来源的外泌体显著促进血管内皮细胞的成管过程，同时通过调节T细胞的免疫功能缩小了梗死面积，改善心脏功能。这项研究表明外泌体可显著促进心血管内皮细胞的成管，并降低了脾脏淋巴细胞的增殖。Feng等[15]发现间充质干细胞分泌富含miRNA-22的外泌体通过直接靶向甲基CpG结合蛋白2（Mecp2）介导心肌抗凋亡作用，显著减轻心肌纤维化。

3.2 内皮细胞来源的外泌体 活化的内皮细胞在AS的发展中起重要作用，因为它们是由血管平滑肌细胞异常增生而形成的新生内膜。值得注意的是，内皮细胞来源的外泌体可以调节炎症和单核细胞的活化及迁移，其通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，减轻心肌细胞缺血/再灌注（I/R）损伤[16]。Saez等[17]发现2型糖尿病患者中，内皮细胞和单核细胞来源的外泌体在高糖状态下促进细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达，提示外泌体可能作为单核细胞和内皮细胞之间的通讯机制，在高糖状态下诱导和维持两种类型细胞的激活。Hu等[18]发现内皮祖细胞来源的外泌体通过传递miRNA-21-5p调节血小板反应蛋白-1（TSP-1）的表达，促进血管内皮细胞的修复。Li等[19]研究发现通过激活CD137信号通路可减少10/11易位家族蛋白2（TET2）含量并增强内皮细胞来源的外泌体转移到血管平滑肌细胞来促进新内膜的形成。

3.3 平滑肌细胞来源的外泌体 成熟的可收缩血管的平滑肌细胞是一种静态细胞。其通过维持血管壁的完整性和调节动脉张力，在血管的传导功能中起着关键作用。衰老、氧化应激、炎症和机械损伤等刺激可诱导血管平滑肌细胞表型改变，血管平滑肌细胞从收缩状态向“合成”状态转化导致血管病变，包括AS、血管钙化和再狭窄。外泌体在血管修复过程、病理性血栓形成和钙化中发挥着新的作用[20]。血管平滑肌细胞来源的外泌体可介导Krüppel样因子5（KLF5）诱导miRNA-155从平滑肌细胞向内皮细胞转移，增加内皮细胞的通透性，促进AS进展[21]。Qiu等[22]发现血管平滑肌细胞来源的外泌体是一种新的血管内血栓形成的关键调节介质，提示血管平滑肌细胞来源的外泌体介导的功能失调可能干扰血管稳态，从而导致冠心病发生。

3.4 心肌细胞来源的外泌体 越来越多的证据表明，心肌细胞来源的外泌体在冠心病的进展中起着重要作用。心肌细胞来源的外泌体的产生和释放受多种因素的影响。近期研究发现热休克蛋白20（HSP20）通过与肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）的相互作用介导外泌体在心肌细胞中的生物形成及分泌[23]。心肌细胞来源的外泌体可通过转移糖酵解酶和葡萄糖转运体来调节内皮细胞的糖酵解通量，进而影响心肌细胞的功能[24]。Yang等[25]发现双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶2（DYRK2）为miRNA-208a的靶基因，心肌细胞通过分泌富含miRNA-208a的外泌体参与心肌纤维化，外泌体促进成纤维细胞增殖并分化为肌成纤维细胞。而在小鼠心肌梗死模型中，发现在体内抑制富含miRNA-208a的外泌体可减轻心肌纤维化，改善心肌梗死后小鼠心功能。同时将含miRNA-208a的外泌体输入正常大鼠，会导致心功能恶化。Wang等[26]证明了miRNA-92a作为Smad蛋白7（Smad7）转录调控因子，而Smad7是α-平滑肌肌动蛋白的一种抑制剂。心肌梗死后心肌细胞中miRNA-92a上调，减弱Smad7介导的对α-平滑肌肌动蛋白转录的抑制，从而触发心肌细胞转化为肌成纤维细胞。这种通路对心肌成纤维细胞的激活至关重要。

3.5 脂肪细胞来源的外泌体 脂肪组织是循环外泌体miRNA的主要来源之一，这些外泌体中miRNA可以调节远处组织的基因表达，从而成为新的脂肪因子[27]。脂肪组织的内分泌功能为肥胖与AS的联系机制提供了重要的线索。据报道，脂肪因子和细胞因子通常影响脂肪和葡萄糖的代谢。而在肥胖的情况下直接影响血管功能，在AS形成中发挥重要作用[28]。Gan等[29]证实miRNA-130b-3p聚集在功能失调的脂肪细胞来源的小细胞外囊泡中，抑制心肌细胞中多种抗凋亡和保护心肌细胞分子，从而加重糖尿病患者心肌的I/R损伤。Deng等[30]发现脂肪细胞来源的外泌体通过激活S1P/SK1/S1PR1信号通路促进巨噬细胞M2极化来改善心肌梗死后的心肌损伤。并且其通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB（NF-κB）通路，可降低ICAM的表达，减轻低密度脂蛋白受体缺陷小鼠的AS[31]。

4 外泌体在冠心病潜在的诊断和治疗应用

近年来，外泌体在冠心病的诊断和治疗潜力得到了越来越多的研究[4]。冠心病中特别是心肌梗死方面是目前外泌体研究的热点，并主要围绕各种保护因子展开。在基因层面上，外泌体携带的miRNA-30a抑制剂可通过下调自噬激活激酶1（ULK1）和自噬基因编码蛋白-1（Beclin-1）水平来抑制心肌细胞凋亡。Xu等[32]随机将30只小鼠分成假手术组、模型组、miRNA30a抑制剂组，结扎模型组及miRNA-30a抑制剂组的前降支血管，模型组与假手术组相比，心脏组织的病理损伤严重，血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和肌酸激酶（CK）水平升高，丙二醛（MDA）含量降低，超氧化物歧化酶（SOD）含量升高，心脏细胞凋亡率明显增加。同时模型组心脏组织中自噬相关蛋白ULK1和Beclin-1水平也显着增加。而miRNA-30a抑制剂组结果与之相反。不仅如此，相关研究也发现急性心肌梗死患者外泌体中的miRNA-30a水平呈时间依赖性升高[33]。

Peng等[34]将miRNA-122-5p模拟物转染给小鼠H9C2细胞，发现血浆中miRNA-122-5p的水平明显升高。miRNA-122-5p模拟物处理过表达X染色体失活特异转录物（XIST）的H9C2细胞后，其细胞活力、迁移和侵袭能力均下降。与此同时miRNA-122-5p模拟物可以显著增加心肌细胞凋亡程度，降低B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）蛋白表达，增加低氧诱导因子-1（HIF-1）及凋亡因子（如Bax、caspase-9）表达。同时研究发现血清中高miRNA-122-5p/133b比值所反映的miR122-5p的相对升高是一种预测性生物标志物，可用于识别预后风险较高的ST段抬高型心肌梗死患者。当联合左心室射血分数，早期预后价值则明显上升[33]。

Zhao等[35]发现转基因小鼠过度表达miRNA-328后激活转化生长因子-β（TGF-β），增强了胶原蛋白沉积并诱发心脏纤维化，并且在敲除小鼠内源性miRNA-328后消除了这种作用。此外，心肌细胞来源的miRNA-328通过旁分泌转运至心肌成纤维细胞，过表达刺激TGF-β信号通路，包括上调转化生长因子-β1和磷酸化smad2/3的表达，下调转化生长因子-β受体Ⅲ（TGF-βRⅢ），最终导致胶原蛋白含量的增加。miRNA-328作为一种通过旁分泌信号传导导致心脏纤维化的新型分子机制，证明了miRNA-328是潜在的治疗靶点。Xiao等[36]发现在大鼠心肌缺血模型H9C2细胞中敲除miRNA-134可减轻心肌I/R损伤，通过调节磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶（PI3K/Akt）通路并靶向一氧化氮合酶3（NOS3），减弱心肌凋亡并增强增殖能力。临床实验发现相比于健康对照组，急性心肌梗死患者血浆外泌体中miRNA-328和miRNA-134水平明显升高，在经过年龄和性别矫正后二者仍与患者6月内死亡或心力衰竭的风险密切相（OR=7.35，P＜0.001 vs. OR=2.28，P＜0.001），因此血浆中miRNA-328和miRNA-134是重要的死亡预测生物标志物[37]。

在蛋白层面上，外泌体在抑制心室重构，改善心功能发挥重要作用。如间充质干细胞来源的外泌体通过传递白细胞介素10（IL-10）和TGF-β等来抑制促炎细胞因子的表达，从而发挥抗炎作用[38]。Yamaguchi等[39]证实心肌细胞来源的外泌体富含胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）有助于改善心肌梗死后的心功能。

5 结语与展望

我们讨论了外泌体的生物发生、分泌和摄取及其在冠心病治疗应用的最新研究结果。目前研究表明，关于外泌体相关知识很大一部分来自培养的细胞或者缺乏生理或临床相关性囊泡浓度的研究，对人体中心脏、血管壁和循环细胞释放的外泌体知之甚少[40]。但外泌体生物学代表了未来治疗心脏疾病的一个引人入胜的领域，通过靶向手段可能作为治疗冠心病的新的方向。因此，外泌体在冠心病的临床诊断和治疗中充满希望，但仍需更多的临床和基础研究数据进一步探讨证实。