干扰LINC00265上调miR-485-5p的表达影响缺氧诱导的心肌细胞凋亡、增殖机制研究

朱银川，王丰云，杨雁华，宿东升，汤建民

心肌细胞凋亡参与了多种心血管疾病的发生及发展，如心肌梗死、心力衰竭及心律失常等；因此抑制心肌细胞凋亡，保护正常心肌细胞功能对治疗多种心血管疾病有重要意义[1,2]。研究表明长链非编码RNA（lncRNA）与心血管疾病的发生及发展有关[3]。研究报道LINC00265是缺血性卒中重要的lncRNAs生物标志物[4]。LINC00265在急性心肌梗死患者中上调表达[5]。LINC00265通过使miR-let-7a变海绵促进血管炎症和腹主动脉瘤的形成[6]。然而LINC00265对缺氧诱导的心肌细胞凋亡、增殖的影响及其机制尚不清楚。微小RNA（miRNA）是一类有调控功能的小分子非编码RNA，miRNA与心血管疾病密切相关，参与了心肌肥厚、心肌纤维化、动脉粥样硬化等，可作为一种生物标记物，为疾病诊断与治疗提供新依据[7]。研究报道miR-485-5p过表达可阻止苯肾上腺素诱导的线粒体裂变和心肌肥大[8]。因此本实验旨在研究LINC00265对缺氧诱导的心肌细胞凋亡、增殖的影响及其机制是否与miR-485-5p有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料 心肌细胞H9C2购自无锡欣润生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自；Trizol试剂、反转录试剂盒、SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自日本Takara公司；细胞周期检测试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司；抗体购自武汉维诺赛生物技术有限公司。

1.2 分组 将H9C2细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，取对数生长期细胞H9C2，将其置于含95%N2和5%CO2的培养箱中缺氧处理3 h，然后于正常培养条件下培养，记为模型组，正常培养的细胞作为对照组。将LINC00265干扰质粒转染至H9C2细胞后进行缺氧处理，记为模型组+si-LINC00265组；将LINC00265干扰质粒阴性对照转染至H9C2细胞后进行缺氧处理，记为模型组+si-NC组；将miR-485-5p模拟物转染至H9C2细胞后进行缺氧处理，记为模型组+miR-485-5p组；将miR-485-5p模拟物阴性对照转染至H9C2细胞后进行缺氧处理，记为模型组+NC组。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测LINC00265和miR-485-5p的表达水平 提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明配制反应体系，进行PCR，循环条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量用 2-△△Ct法计算。LINC00265和miR-485-5p分别以GAPDH和U6为内参，LINC00265上游引物序列：5"-GG AAGAGAGACTGACTGGGC-3"，下游引物序列：5"-GTTTCGCTGTCACCCCTCTG-3"；GAPDH上游引物序列：5"-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3"，下游引物序列：5"-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCA GT-3"；miR-485-5p上游引物序列：5"-ACACTCC AGCTGGGAGAGGCTGGCCGTGATGAATTC-3"，下游引物序列：5"-CTCGATTCGTCACTCACA-3"；U6上游引物序列：5"-CGCTTCGGCAGCACATATACT A-3"，下游引物序列：5"-CGCTTCACGAATTTGCG TGTCA-3"。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期 收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，离心沉淀细胞，弃上清；然后重悬细胞，加入预冷的80%乙醇，4℃固定过夜；用PBS洗涤细胞3次，加入核糖核酸酶A（RNase A），37℃孵育30 min，加入碘化啶（PI）染色液，4℃染色15 min，上机检测激发波长488 nm处红色荧光，用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件对细胞周期进行分析。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 取转染48 h后生长状态良好的细胞，PBS漂洗细胞2次，吸弃PBS液，加1～2 ml胰酶消化细胞使之脱壁，然后加入结合缓冲液终止消化，制成细胞悬液，分别加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，轻摇混匀，常温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.6 蛋白质印迹（Western blot）法检测Ki67、Caspase3蛋白表达 用放射免疫沉淀分析裂解液（RIPA）提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照40 μg/孔上样蛋白，进行SDS-PAGE，然后转膜、封闭，洗膜，加入稀释好的一抗（1:500），室温摇床孵育2 h，倒掉一抗，加入按照1:3000稀释的HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h，加入ECL发光液，暗室下显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。实验重复3次。

1.7 双荧光素酶报告实验验证LINC00265和miR-485-5p的靶向关系 使用PCR扩增包含miR-485-5p结合位点的LINC00265序列片段，并构建至荧光素酶表达载体中，获得LINC00265野生型载体（WT-LINC00265），将LINC00265序列 CAGCCTCT突变为GCCAAGAA，获得LINC00265突变型载体（MUT-LINC00265），将WTLINC00265、MUT-LINC00265分别与miR-NC、miR-485-5p用Lipofectamine 2000脂质体共转染至细胞中，转染48 h后，根据试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.8 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差χ2表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测LINC00265和miR-485-5p的表达 与对照组比较，模型组LINC00265表达水平升高，miR-485-5p表达水平降低（P＜0.05）；与模型组+si-NC组比较，模型组+si-LINC00265组LINC00265表达水平降低，miR-485-5p表达水平升高（P＜0.05）；与模型组+miR-NC组比较，模型组+miR-485-5p组LINC00265表达水平降低，miR-485-5p表达水平升高（P＜0.05）（表1）。

表1 LINC00265和miR-485-5p在缺氧诱导的H9C2中的表达（±s，n=3）

表1 LINC00265和miR-485-5p在缺氧诱导的H9C2中的表达（±s，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与模型组+si-NC比较，cP＜0.05；与模型组+miR-NC比较，dP＜0.05

分组 LINC00265 miR-485-5p对照组 0.98±0.07 1.00±0.06模型组 3.23±0.11a 0.23±0.02a模型组+si-NC 3.27±0.11a 0.23±0.02a模型组+si-LINC00265 1.84±0.09abc 0.62±0.04abc模型组+miR-NC 3.26±0.09a 0.24±0.02a模型组+miR-485-5p 1.43±0.08abd 0.83±0.04abd F值 378.171 262.328 P值 0.000 0.000

2.2 细胞周期的检测 与对照组比较，模型组G0-G1期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例降低（P＜0.05）；与模型组+si-NC组比较，模型组+si-LINC00265组G0-G1期细胞所占比例降低，S期细胞所占比例升高（P＜0.05）；与模型组+miR-NC组比较，模型组+miR-485-5p组G0-G1期细胞所占比例降低，S期细胞所占比例升高（P＜0.05）；各组间G2-M期细胞所占比例无显著变化（P＞0.05）（表2）。

2.3 流式细胞术检测干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2凋亡的影响 与对照组比较，模型组G0-G1期细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组+si-NC组比较，模型组+si-LINC00265组细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与模型组+miR-NC组比较，模型组+miR-485-5p组G0-G1期细胞细胞凋亡率降低（P＜0.05）（图1，表3）。

2.4 Western Blotting检测干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2中Ki67、Caspase3的影响 与对照组比较，模型组G0-G1期Ki67表达水平降低，Caspase3表达水平升高（P＜0.05）；与模型组+si-NC组比较，模型组+si-LINC00265组Ki67表达水平升高，Caspase3表达水平降低（P＜0.05）；与模型组+miR-NC组比较，模型组+miR-485-5p组Ki67表达水平升高，Caspase3表达水平降低（P＜0.05）（图2，表4）。

表2 干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2细胞周期的影响（±s，n=3）

表2 干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2细胞周期的影响（±s，n=3）

注： G1：DNA合成前期；S：DNA合成期；G2：DNA合成后期；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与模型组+si-NC比较，cP＜0.05；与模型组+miR-NC比较，dP＜0.05

分组 G0-G1 S G2-M对照组 33.58±1.03 33.50±0.94 32.92±1.03模型组 44.22±0.96a 23.36±0.63a 32.42±1.11模型组+si-NC 44.37±0.87a 23.29±0.64a 32.34±0.91模型组+si-LINC00265 38.45±0.84abc28.85±0.75abc32.70±0.75模型组+miR-NC 44.53±0.70a 23.27±0.59a 32.20±0.64模型组+miR-485-5p 36.41±0.69abd31.13±0.58abd32.46±0.87 F值 92.653 126.651 0.252 P值 0.000 0.000 0.931

图1 流式细胞术检测H9C2凋亡率

表3 干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2凋亡的影响（ ±s，n=3）

表3 干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2凋亡的影响（ ±s，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与模型组+si-NC比较，cP＜0.05；与模型组+miR-NC比较，dP＜0.05

分组 凋亡率（%）对照组 7.47±0.48模型组 22.53±1.03a模型组+si-NC 22.60±0.98a模型组+si-LINC00265 images/BZ_113_1690_1559_1690_1564.png16.16±0.70abc模型组+miR-NC 22.62±0.87a模型组+miR-485-5p 11.84±0.58abd F值 198.473 P值 0.000

图2 Western Blotting检测Ki67、Caspase3蛋白的表达

2.5 LINC00265靶向miR-485-5p Starbase数据库预测显示LINC00265与miR-485-5p存在互补的核苷酸序列（图3）。双荧光素酶报告实验结果显示，WT-LINC00265与miR-485-5p共转染后，与miR-NC共转染后相比，细胞荧光活性降低（P＜0.05）；MUT-LINC00265与miR-485-5p共转染后细胞荧光活性无显著变化（P＞0.05）（表5）。

3 讨论

表4 干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2中Ki67、Caspase3的影响（±s，n=3）

表4 干扰LINC00265和过表达miR-485-5p对缺氧诱导的H9C2中Ki67、Caspase3的影响（±s，n=3）

注：Ki67：核增殖抗原；Caspase3：半光酰天冬氨酸特异性蛋白酶3；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与模型组+si-NC比较，cP＜0.05；与模型组+miR-NC比较，dP＜0.05

分组 Ki67 Caspase3对照组 0.70±0.05 0.19±0.01模型组 0.15±0.02a 0.69±0.04a模型组+si-NC 0.14±0.02a 0.70±0.05a模型组+si-LINC00265 0.42±0.03abc 0.34±0.02abc模型组+miR-NC 0.14±0.01a 0.70±0.04a模型组+miR-485-5p 0.57±0.03abd 0.25±0.02abd F值 210.415 162.264 P值 0.000 0.000

图3 LINC00265靶向miR-485-5p

表5 双荧光素酶报告实验（±s，n=3）

表5 双荧光素酶报告实验（±s，n=3）

注：WT-LINC00265：野生型LINC00265；MUT-LINC00265：突变型LINC00265

分组 WT-LINC00265 MUT-LINC00265 miR-NC 0.96±0.07 0.98±0.08 miR-485-5p 0.29±0.02 0.97±0.04 t值 15.940 0.194 P值 0.000 0.856

缺氧是造成心肌细胞凋亡的重要原因，而心肌细胞凋亡引起的心肌损伤是缺血性心肌病发生的重要机制；深入研究缺氧诱导心肌细胞凋亡的分子机制，对相关疾病的治疗具有一定参考意义[9,10]。研究表明lncRNA可参与调控缺血性心肌病的发生和发展，有望成为心血管疾病的新型诊断学标记物或药物治疗靶点[11]。已有研究表明，LINC00265与心肌梗死的发生有关，但具体机制尚不清楚[5]。本实验用缺氧诱导心肌细胞，结果显示，缺氧的确可诱导心肌细胞凋亡；且缺氧诱导的心肌细胞中LINC00265表达水平升高；干扰LINC00265表达后，G0-G1期细胞所占比例降低，S期细胞所占比例升高，细胞凋亡率降低，Ki67表达水平升高，Caspase3表达水平降低。Ki67是一种细胞增殖抗原，其可作为细胞增殖活性的检测指标[12]。Caspase3是细胞凋亡过程中的关键调控因子，其高表达可促进细胞凋亡[13]。本实验结果表明干扰LINC00265可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。

lncRNA与miRNA间存在着相互调控关系，两者间的相互作用参与了众多疾病的发生发展[14]。本实验通过Starbase数据库预测与LINC00265相关的miRNA，结果显示LINC00265与miR-485-5p存在互补的核苷酸序列，双荧光素酶报告实验进一步证实LINC00265靶向调控miR-485-5p。研究报道miR-485-5p通过靶向Rac1/Notch2信号传导保护了神经细胞免受脑缺血/再灌注损伤[15]。miR-485-5p通过调控肿瘤坏死因子受体1型相关的DEATH结构域蛋白（TRADD）保护神经元细胞免于肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导的凋亡[16]。本实验结果显示，缺氧诱导的心肌细胞中miR-485-5p表达水平降低，过表达miR-485-5p可降低细胞凋亡率，提高Ki67表达水平，降低Caspase3表达水平。表明表达miR-485-5p可减弱缺氧诱导的心肌细胞凋亡。

综上所述，干扰LINC00265可能通过上调miR-485-5p的表达抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡、促进细胞增殖。