大孔吸附树脂纯化桦褐孔菌三萜类化合物工艺优化

檀琪，阮文辉，杨官娥，刘海萍，郭素萍，王进东,

1. 山西医科大学药学院（太原 030001）；2. 山西省医药与生命科学研究院（太原 030001）；3. 山西省药品监督管理局技术审评中心（太原 030001）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又称白桦茸，是一种药用真菌[1-4]，主要分布在欧洲及北美地区[5]。桦褐孔菌的主要成分有三萜类、多糖类、甾类、多酚类等[6-11]。桦褐孔菌是一种天然的药食两用型真菌，近年来国内外研究人员对桦褐孔菌的提取分离技术及药效等研究越来越重视，关于桦褐孔菌化学成分的研究较多，其中三萜类成分不仅是桦褐孔菌子实体中的主要成分，也是其活性成分[12-14]。研究显示，桦褐孔菌里的三萜类成分具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、增强免疫活性等功能，同时具有结构简单、分子量小、毒副作用小等优点[15-20]。

原料经过提取得到的粗提物化学成分较为复杂，需要进行进一步分离纯化，常见三萜类化合物的纯化方法有大孔树脂、ODS柱、硅胶、凝胶色谱法等[21-24]。三萜类化合物分离纯化最常用的方法是色谱法，亦是最有效的方法。大孔吸附树脂色谱是一种不含交换基团、有大孔结构的有机高聚物吸附剂，具有吸附和分子筛双重作用，因其成本低、吸附容量大、选择性好、树脂再生简便、解吸容易、洗脱率高、可再生等优点，在工业纯化有效成分领域应用越来越广泛[25-27]。此次试验采用大孔树脂对桦褐孔菌粗提物进行纯化，得到一种高效、快速、可靠的桦褐孔菌中三萜类化合物的提取、富集工艺，为桦褐孔菌的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桦褐孔菌子实体粉末（安徽亳州）；白桦脂醇对照品（HPLC纯度＞97.6%，Chroma Dex，批号20151008）。香草醛（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；冰醋酸、高氯酸、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇（均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；AB-8、DM130、D101、HPD100、LSA-21大孔树脂（西安蓝晓科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

BIOMATE 3S紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher）；BSN-220.3电子天平（北京塞多利斯有限公司）；HH-6电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；GZX-9140电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；LYNX-6000离心机（Thermo Fisher）；振动式药物超微粉碎机（济南倍力粉技术工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 桦褐孔菌总三萜粗提物的制备

在前期研究基础上[28]，取干燥后的桦褐孔菌粉末，加22倍的异丙醇于80 ℃回流提取1次，时间为2.5 h，离心（3 500 r/min，10 min），备用。

1.3.2 三萜类化合物检测

采用紫外-可见分光光度法[29]。准确称取4.0 mg干燥恒质量的白桦脂醇对照品于25 mL的容量瓶中，加入无水乙醇溶解，稀释至刻度摇匀，即可得到质量浓度0.16 mg/mL的对照品溶液。精确吸取0.1，0.15，0.25，0.30，0.35，0.40，0.50和0.55 mL白桦脂醇对照品溶液，分别置于10 mL具塞试管，在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 mL新配制的5 g/100 mL香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸溶液，摇匀，于70 ℃水浴保温反应15 min，冷却至室温，再加入乙酸乙酯定量至5 mL，摇匀，同时作试剂空白，在550 nm处测定吸光度，以白桦脂醇质量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.008 5X-0.021 9，R2=0.999 4。用于三萜类化合物的检测。

1.3.3 静态吸附-解吸试验

1.3.3.1 静态吸附试验

分别准确称取1.00 g预处理好的大孔树脂（AB-8、D101、DM130、HPD100、LSA21）于100 mL锥形瓶中，分别加入50 mL已测定质量浓度的桦褐孔菌三萜样品液，置于摇床中以100 r/min振荡12 h，吸附平衡后过滤，测定吸光度并计算溶液中三萜类化合物质量浓度。计算5种树脂对三萜类化合物的比吸附容量以及吸附率。按式（1）和式（2）计算。

式中：Qe为比饱和吸附量，mg/g；C0为吸附前样液质量浓度，mg/mL；V0为吸附前样液体积，mL；C1为吸附过滤后样液质量浓度，mg/mL；V1为吸附过滤后样液体积，mL；M为大孔树脂质量，g。

1.3.3.2 静态解吸试验

将按1.3.3.1项下吸附饱和的树脂加入140 mL质量分数为90%的乙醇中，置于摇床中以100 r/min振荡12 h进行解吸，过滤测定吸光度并计算溶液中三萜类化合物质量浓度，计算5种树脂对三萜类化合物的解吸率。按式（3）计算。

式中：C0为吸附前样液质量浓度，mg/mL；V0为吸附前样液体积，mL；C1为吸附过滤后样液质量浓度，mg/mL；V1为吸附过滤后样液体积，mL；C2为解吸液质量浓度，mg/mL；V2为解吸过滤后样液体积，mL。

1.3.4 动态吸附-解吸试验

1.3.4.1 动态吸附泄漏曲线的绘制

准确称取10 g预处理好的大孔树脂，装入玻璃柱中，将质量浓度为0.2 mg/mL桦褐孔菌三萜粗提液以1 mL/min的流速进行连续上样，收集流出液（每1 BV为1份），测定每份流出液的吸光度，计算流出液中总三萜的含量，以流出液体积为横坐标，有效物质质量浓度为纵坐标，绘制大孔树脂动态吸附泄漏曲线。

1.3.4.2 上柱液质量浓度对吸附效果的影响

准确称取10 g预处理好的大孔树脂，分别装入玻璃柱中，以对三萜类化合物吸附量为考察指标，取1.3.1项下样品溶液，分别稀释至质量浓度为0.02，0.05，0.1，0.15和0.2 mg/mL，共5份，相同流速上柱，测定吸附后的吸光度并计算溶液中三萜化合物的含量，以分析样品质量浓度对大孔树脂吸附的影响。

1.3.4.3 上柱流速对吸附效果的影响

准确称取10 g预处理好的大孔树脂，分别装入玻璃柱中，取相同体积和质量浓度三萜化合物样品溶液，分别以1.0，2.0和3.0 mL/min的流速上进行上样，收集流出液（每1 BV为1份），测定每份流出液的吸光度，计算流出液中总三萜的含量，以分析上样流速对大孔树脂吸附的影响。

1.3.4.4 洗脱剂体积分数对解吸率的影响

准确称取10 g预处理好的大孔树脂，分别装入玻璃柱中，装柱按优选的上样量进行动态吸附，待吸附完成后，分别以体积分数30%，50%，60%，70%和90%的乙醇溶液以2 mL/mim进行洗脱，收集流出液（每1 BV为1份），测定每份流出液的吸光度，计算洗脱液中总三萜的含量，以分析洗脱剂体积分数对解吸效果的影响。

1.3.4.5 洗脱剂用量对解吸率的影响

准确称取10 g预处理好的大孔树脂，分别装入玻璃柱中，按优选的上样量进行动态吸附，待吸附完成后，用60%乙醇溶液洗杂2 BV，加入体积分数为90%乙醇进行洗脱，收集流出液（每1 BV为1份），测定每份流出液的吸光度，计算洗脱液中总三萜的含量，以分析洗脱剂用量对解吸效果的影响。

1.3.4.6 洗脱流速对解吸率的影响

准确称取10 g预处理好的大孔树脂，径高比为1∶4，分别装入玻璃柱中，按优选的上样量进行动态吸附，待吸附完成后，分别以1.0，2.0和3.0 mL/min的流速进行洗脱，收集流出液（每1 BV为1份），测定每份流出液的吸光度，计算洗脱液中总三萜的含量，以分析洗脱剂流速对解吸效果的影响。

2 结果和分析

2.1 大孔树脂静态吸附性能比较及筛选

筛选合适的树脂是大孔吸附树脂分离纯化的第一步，亦是关键步骤之一。根据大孔树脂分离纯化的基本原理，选取了5种树脂进行试验，以静态吸附法对树脂进行筛选，结果如表1所示。LSA21对桦褐孔菌三萜的吸附率较低，HPD100、LSA21和D101解吸率明显低于其他2种树脂；相对来说，AB-8具有较好的吸附性能和解吸性能，比饱和吸附量为9.67 mg/g，解吸率为87.09%。因此，选择AB-8树脂进行下一步的动态吸附-解吸试验。

2.2 大孔树脂动态吸附泄漏曲线

在大孔树脂动态吸附过程中，当上样条件一定时，上样液流过树脂，三萜类化合物会被树脂吸附，经过一定时间，三萜类化合物在树脂与上样液中分配达到平衡，即溶液中的三萜类化合物不断被树脂吸附，同时吸附在树脂上的三萜类化合物又不断脱附，当吸附达到平衡时，出现泄漏[30]。在树脂吸附过程中，一般认为泄漏点为流出溶液中三萜类化合物浓度为原上样浓度的1/10时对应的流出液体积。由图1可知，当流出液体积为4 BV时，出现泄漏点。随着上样量的增加，桦褐孔菌三萜从开始就有少量泄漏，AB-8树脂对总三萜的泄漏率呈增加趋势；当上样体积低于14 BV时，收集液浓度均在20 μg/mL以下并且增长缓慢；在14 BV后，泄露明显；继续上样将产生更大的泄漏。所以选择14 BV为最佳上样量。

表1 大孔树脂静态吸附性能比较

图1 大孔树脂动态吸附泄漏曲线

2.3 上样液质量浓度对吸附效果的影响

由图2可知，随着上样液质量浓度的提高，三萜类物质的吸附率不断升高，当上样液质量浓度为0.2 mg/mL时，吸附量达到最大，为7.666 mg/g。从理论上讲，上样液质量浓度越高，吸附率应该越高，因为质量浓度差越大越有利于扩散。但试验前期研究样品溶解度等综合因素，发现样品质量浓度不宜超过0.2 mg/mL。综上，上样液质量浓度选择0.2 mg/mL。

图2 上样液质量浓度对三萜类化合物吸附量的影响

2.4 上样流速对吸附的影响

由图3可知，当上样流速为1.0，2.0和3.0 mL/min时，上样终点（流出液质量浓度为上样液质量浓度的1/10时）分别出现在15，3和2 BV附近。当上样流速为2 mL/min时，上样终点出现最早，原因是上柱流速过快会使传质过程无法完全进行，从而引起泄露。如果流速较慢，有效成分被大孔树脂充分接触，吸附量增加，但吸附时间增加会造成生产过程过长。综合考虑吸附效果和工作效率，最终选择1 mL/min上样流速。

图3 不同上样流速时的吸附效果

2.5 不同体积分数乙醇解吸液的解吸效果

由图4可知，随着洗脱剂乙醇体积分数的增加，洗脱剂对桦褐孔菌三萜类化合物的解吸能力增大，表现为三萜类化合物的解吸率随着乙醇体积分数的升高而增加。原因是乙醇体积分数越高，极性越小，而弱极性的AB-8树脂与极性较小的三萜类化合物极性相似，越容易被洗脱下来，故三萜类化合物的解吸率随着乙醇的体积分数升高而升高，但考虑到乙醇体积分数越大，不仅有效成分会洗脱出来，杂质也会被洗脱下来，故确定用60%乙醇除去杂质，再用90%乙醇富集三萜类成分。

图4 不同体积分数乙醇的解吸效果

2.6 动态解吸曲线

由图5可知，以90%乙醇洗脱，质量浓度峰值出现在1～4 BV，其中洗脱液体积为2 BV时总三萜含量最高；18 BV后三萜质量浓度已经很小，只有23.32 μg/mL。18 BV时已流出总解吸液95.78%的三萜化合物。综合考虑，18 BV为合理的洗脱剂用量。

图5 AB-8树脂动态解吸曲线

2.7 不同洗脱流速的洗脱效果

由图6可知，以1.0 mL/min的速度洗脱时峰形较窄；而以2.0或3.0 mL/min的速度洗脱则峰形变宽。当洗脱流速为1 mL/min时，洗脱率最高，2.0 mL/min与3.0 mL/min的解吸量差异小，但二者均显著低于1.0mL/min。综合考虑洗脱率和洗脱效率，1.0 mL/min的洗脱流速较为合理。

图6 不同解吸流速时的解吸曲线

2.8 纯化后三萜化合物的纯度

桦褐孔菌三萜粗提物经AB-8大孔树脂吸附、90%乙醇洗脱、水浴挥干至恒质量，得淡黄色粉末，即为桦褐孔菌三萜。纯度可达85.13%，与纯化前总三萜质量分数为28%，提高了2.04倍。说明上述纯化工艺效果明显，具有实际应用性。

3 结论

此次试验采用大孔树脂对桦褐孔菌提取物中的总三萜进行纯化，选择AB-8大孔树脂作为理想树脂。经过以上考察，得到最佳分离纯化工艺条件：上样液质量浓度0.2 mg/mL，上样流速1 mL/min，上样体积14 BV，洗脱流速1 mL/min，最后用90%洗脱18 BV。在此条件下，三萜类化合物的纯化率可达到85.13%。结果表明，利用大孔吸附树脂可以对植物内的活性化合物实现高效富集，除去杂质化合物以提高有效成分的含量，大孔吸附树脂分离富集桦褐孔菌三萜化合物技术的应用过程操作简单且可扩大化生产。此次试验可为更好地研究和应用这一药用真菌、深入开发利用这一资源、扩大药物的适用范围、进一步研究发现其药理活性物质奠定基础。