云南木蠹象幼虫危害的云南松树皮及木质部挥发性成分研究

杨 燕 杨再华 峗薇 尚小丽 罗倩 杨茂发

(1.贵州师范学院生物科学学院，贵州 贵阳550018； 2.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005；3.四川省江油市农业农村局，四川 江油 621700；4.贵州医科大学基础医学院，贵州 贵阳 550004；5.贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州大学昆虫研究所，贵州 贵阳 550025；)

云南松(Pinusyunnanensis)隶属于裸子植物亚门Gymnospermae松杉目Pinales松科Pinaceae松属Pinus，常绿针叶乔木，是我国西南地区重要的用材林树种，也是绿化和更新造林的重要树种[1-2]。这一树种也不可避免地会遭到不同昆虫的取食与危害，其中钻蛀害虫云南木蠹象Pissodesyunnanensis在我国西南地区包括云南、贵州、四川等地云南松林区常有危害。当前在贵州省威宁县针对云南木蠹象的防治依然以清理被害枝梢烧毁为主，此方法费时费工费钱，也不利于水土保持和森林生态。因此，为探索有效、安全、经济的防治新方法和新技术，我们展开了天敌昆虫定向寄主选择行为相关化学信号的研究。

信息化合物在天敌搜寻寄主的过程中起着重要作用，这些信息化学物质一般来源于寄主取食的植物、寄主本身或者分泌物，以及一些与寄主相关的有机体等[3-13]。天敌在害虫综合治理和生物防治中占有非常重要的地位，是自然控制害虫种群密度的一个重要组成部分。该文利用固相微萃取技术，对云南木蠹象幼虫危害的云南松带虫树皮和带虫木质部挥发性成分进行了萃取、分离和鉴定，以期为探索天敌昆虫与云南木蠹象之间的信息联系机制，天敌寄生蜂定向到该虫的种间化学信号，为筛选对天敌昆虫具有生物活性的引诱剂工作的开展，并实现对该虫的生态控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

有云南木蠹象幼虫在其中取食危害的云南松枝条采自贵州省威宁县秀水乡华丰村(N26.85，E103.91)云南松林区，海拔2430m。采集的带虫云南松枝条，置于恒温25±1℃的人工气候室内培养几天供试。

1.2 仪器

美国安捷伦公司HP6890/5975CGC-MS联用仪、手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)、萃取纤维头为PDMS100μm萃取头、TB-4002型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、铁架台、样品瓶、记时器。

1.3 固相微萃取

分别称取3g云南木蠹象幼虫取食危害的带虫云南松树皮和带虫木质部，放入50mL样品瓶中，室温25℃± 1℃的条件下保持30 min，样品瓶内样品与顶空中的挥发物达到动态平衡，将装有100μmPDMS纤维头的手动进样器针头插入样品瓶，固定固相微萃取装置的手柄，然后小心推出萃取纤维头，在室温条件下顶空萃取45 min，快速移出萃取头并立即插入GC-MS进样口进行GC-MS测试，250℃热解析5 min。

1.4 GC-MS分析条件

GC条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温45℃(保留2min)，以5℃.min-1升温至250℃(保留2 min)，运行时间:45min；汽化室温度250℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压7.35 psi，载气流量1.0mL/min；分流进样，分流比20:1，溶剂延迟时间：0.5 min。

MS条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1200V；接口温度280℃；质量范围20～450amu。

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及结合核对Nist 14、Wiley275标准质谱图数据库和部分标准样品谱图，确定挥发物的成分，并按峰面积归一化法计算各化学成分的相对质量分数。

2 结果与分析

云南松带虫树皮和带虫木质部气味挥发性成分总离子流图，见图1，图2。GC-MS分离鉴定出的树皮和木质部挥发性成分及相对含量见表1。由表1可知，采用GC-MS联用技术，分离鉴定出云南松带虫树皮主要挥发性化合物总共37种，已鉴定的化合物占色谱总馏出峰面积的99.83%，相对含量最大的是α-蒎烯，相对含量为74.98%，其次是β- 蒎烯(8.52%)、柠檬烯(7.27%)和莰烯(2.03%)。云南松带虫木质部主要挥发性化合物总共40种，已鉴定的化合物占色谱总馏出峰面积的93.96%，相对含量最大的是α-蒎烯，相对含量为68.40%，其次是反式石竹烯(7.11%)、柠檬烯(5.71%)和β-蒎烯(3.76%)。

图1 带虫云南松树皮挥发物总离子流图

图2 带虫云南松木质部挥发物总离子流图

在云南松带虫树皮所鉴定的化合物中，单萜有14种，相对含量为95.50%；醇类有7种，相对含量为2.14%；倍半萜有7种，相对含量为0.99%；酮类有4种，相对含量为0.27%；醚有2种，相对含量为0.04%；烷烃有1种，相对含量为0.17%；酯类有1种，相对含量为0.7%；烯烃有1种，相对含量为0.02%。在云南松带虫木质部所鉴定的化合物中，单萜有13种，相对含量为80.88%；倍半萜有11种，相对含量为9.58%；醇类有7种，相对含量为1.02%；酮类有5种，相对含量为1.12%；烷烃有2种，相对含量为1.04%；酯类有1种，相对含量为0.32%；氧化物有1种。相对含量为0.09%。在带虫树皮挥发物中，单萜类和醇类相对含量较高，在带虫木质部挥发物中，单萜类和倍半萜类相对含量较高。带虫树皮挥发物中，单萜类、醇类和酯类的相对含量都比带虫木质部挥发物中的相对含量高，而带虫木质部挥发物中，则是倍半萜、酮类和烷烃类组分的相对含量比带虫树皮挥发物中的相对含量高。

表1 云南木蠹象幼虫危害的云南松挥发物

序号化合物分子式相对分子量带 虫 树 皮 带 虫 木 质 部 保留时间相对含量保留时间相对含量38十四烷TetradecaneC14H30198﹣﹣21.870.0739刺伯烯JunipeneC15H2420422.20.23﹣﹣40长叶烯LongifoleneC15H24204﹣﹣22.20.4141反式-石竹烯trans-CaryophylleneC15H2420422.530.6122.537.1142(E)-β-金合欢烯(E)-β-FameseneC15H2420423.360.0323.340.1643α-葎草烯alpha.-HumuleneC15H2420423.390.0623.390.8744γ- 依兰油烯 gamma.-MuuroleneC15H24204﹣﹣23.930.0545大根香叶烯D Germacrene DC15H24204﹣﹣24.060.0446α-依兰油烯alpha.-MuuroleneC15H24204﹣﹣24.510.2247β-没药烯beta.-BisaboleneC15H24204﹣﹣24.660.0248γ- 杜松烯gamma.-CadineneC15H24204﹣﹣24.860.0749δ- 杜松烯delta.-CadineneC15H24204﹣﹣25.060.350石竹烯氧化物Caryophyllene oxideC15H24O220﹣﹣26.530.09

由表1可知，带虫云南松树皮和带虫云南松木质部挥发性成分在组成和含量上差别很大。带虫云南松树皮和带虫云南松木质部共有27种相同的挥发性成分，其中萜烯类有15种，醇类有6种，酮类有4种，酯类有1种，烷烃类有1种。带虫树皮挥发性成分相对含量中有99.4%与带虫木质部相同；带虫木质部挥发性成分相对含量中有92.41%与带虫树皮相同。α-小茴香烯、δ- 3-蒈烯、顺式- 氧化芳樟醇、诺蒎酮、十四烷、长叶烯、γ- 依兰油烯、大根香叶烯D、α-依兰油烯、β-没药烯、γ- 荜澄茄烯、δ- 荜澄茄烯和石竹烯氧化物仅在木质部检测到。脱氢桧烯、α-水芹烯、邻甲基苯甲醚、百里酚甲醚、α-长叶蒎烯、长叶环烯、刺伯烯等成分仅在树皮中检测到。α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、桉树脑在树皮中的相对含量都较在木质部的相对含量高，而反式-石竹烯、对伞花烃、樟脑、松樟酮、异蒎烷酮、马鞭草烯酮、龙脑、4-松油醇、对- 聚伞花素醇、α-松油醇、桃金娘烯醇在树皮中的相对含量都较在木质部的相对含量低。

3 讨论

为探索天敌寄生蜂与云南木蠹象幼虫之间的信息联系机制，研究天敌寄生蜂定向到该虫幼虫的种间化学信号，本文对云南木蠹象幼虫危害的云南松带虫树皮和带虫木质部挥发性成分进行了研究，鉴定出带虫树皮37种挥发性成分，带虫木质部40种挥发性成分。

云南松带虫树皮含有的37种气味化合物，与报道的固相微萃取分离鉴定的健康松皮、受害松皮，徐颖凯等用蒸馏结合气质联用技术分离鉴定的松皮、张晓龙用同时蒸馏萃取法检测松树皮挥发物的基本成分相比较[14-16]，分别有21、20、15和17种相同成分。其中，三环烯、α-蒎烯 、莰烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、乙酸龙脑酯这7种化合物是各种有关云南松树皮挥发物研究报道中均被检测出的共有成分。

本研究带虫树皮挥发物中，α-蒎烯的相对含量为74.98%，莰烯的相对含量为2.03%，β-蒎烯的相对含量为8.52%，β-月桂烯的相对含量为1.74%，柠檬烯的相对含量7.27%。在报道的固相微萃取方法分离鉴定健康树皮挥发物中，α-蒎烯的相对含量为15.945～37.629%，莰烯的相对含量为0.362～1.069%，β-月桂烯的相对含量为5.22～47.759%，柠檬烯的相对含量19.722～39.54%，受害树皮挥发物中，α-蒎烯的相对含量为19.821～59.186%[14]。在徐颖凯等研究中，α-蒎烯的相对含量为0.13%，莰烯的相对含量为0.28%，β-蒎烯的相对含量为27.68%[15]。由此可见，带虫树皮挥发物中α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯和柠檬烯这几种成分与健康树皮的相对含量差异较大。带虫树皮中α-蒎烯和莰烯的相对含量都比健康树皮和不带虫的受害树皮的相对含量高，而β-蒎烯、β-月桂烯和柠檬烯的相对含量都比健康树皮低。是否是云南木蠹象幼虫取食危害诱导的各成分变化有待进一步研究。

云南松带虫树皮气味化合物，与殷彩霞等用石油醚浸提的松梢韧皮挥发物基本成分相比较[17]，共有5种成分相同，分别是α-蒎烯 、莰烯、香桧烯、β-蒎烯和β-月桂烯。α-蒎烯都是相对含量最高的成分。与报道的固相微萃取方法分离鉴定健康云南松韧皮部挥发物基本成分相比较[14]，共有17种成分相同，分别是三环烯、α-侧柏烯、α-蒎烯、莰烯、香桧烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、α-松油烯、对伞花烃、(E)-罗勒烯、γ-松油烯、α-异松油烯、乙酸龙脑酯、α-古巴烯、刺伯烯、α-葎草烯。其中α-蒎烯和莰烯在带虫树皮中的相对含量都比健康韧皮部中的相对含量高，香桧烯、β-月桂烯和α-异松油烯在健康韧皮部中的相对含量则比带虫树皮中的含量高，健康韧皮部香桧烯相对含量为0.725～8.914%、β-月桂烯为11.828～19.925%和α-异松油烯1.585～7.409%，带虫树皮中香桧烯为0.21%、β-月桂烯为1.74%和α-异松油烯为0.29%。

云南松带虫木质部含有的40种气味化合物，与报道的固相微萃取方法分离鉴定健康云南松木质部挥发物基本成分相比较[14]，有13种成分相同，分别是三环烯、α-侧柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯、对伞花烃、γ-松油烯、α-异松油烯、乙酸龙脑酯、α-古巴烯、α-葎草烯。其中β-蒎烯、β-月桂烯在健康木质部中的相对含量比在带虫木质部中的高。健康木质部中β-蒎烯为10.115%，β-月桂烯为3.614%，带虫木质部中β-蒎烯为3.76%，β-月桂烯为0.37%。

本研究中在带虫云南松树皮挥发性成分中检测到了邻甲基苯甲醚和百里酚甲醚，徐颖凯等在健康云南松树皮中检测到的是2-异丙基-5-甲基茴香醚[15]。本文研究云南木蠹象幼虫-云南松复合体的挥发性成分，云南木蠹象幼龄幼虫取食危害云南松树皮韧皮部，逐渐随着幼虫的生长发育，会进而在云南松枝干木质部及髓心取食危害。云南松树皮和木质部在受到云南松幼虫危害后，除了部分化合物与健康植株的挥发物组分相同，还产生不同于健康树皮和木质部的新的挥发性物质，如邻甲基苯甲醚、百里酚甲醚、异蒎烷酮、对-聚伞花素醇等，且与健康植株相同的成分相对含量还发生了显著变化。

受到虫害后的植物挥发物成分上表现出来的质和量的差异是植物与天敌长期协同进化的结果，能给天敌提供精准的化学信号[18-19]，有研究表明，虫害诱导的植物挥发物可以引诱植食性昆虫的天敌[20-22]，云南木蠹象幼虫在云南松树皮和木质部取食危害，天敌寄生蜂是如何精准定位搜索到它，α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯和柠檬烯这几种成分在云南松树皮和木质部受害前后相对含量变化较明显，这几种化合物是否是引诱天敌的主要物质？亦或是新的挥发性物质，如邻甲基苯甲醚、百里酚甲醚、异蒎烷酮、对-聚伞花素醇？或是其它几种或某种化合物共同起作用，仍需通过电生理和行为学实验进一步证明。