HPLC梯度洗脱法同时测定七制香附丸中7种成分的含量△

江华强，严铸云

1.成都市德康医院，四川 成都 610091；2.成都中医药大学，四川 成都 610075

七制香附丸由醋香附、白芍、酒萸肉、地黄等22味中药加工而成，现收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，主要用于气滞血虚所致的痛经、月经量少、闭经，症见胸胁胀痛、经行量少、行经小腹胀痛、经前双乳胀痛、经水数月不行等临床病症的治疗[1]。方中香附疏肝解郁、行气散结、调经止痛，为其君药；白芍养血柔肝、缓急止痛，当归补血活血、调经止痛，熟地黄、阿胶益精、补血养血，益母草、延胡索、川芎活血祛瘀、行气止痛，艾叶、艾叶炭温经散寒止痛，共为臣药；山茱萸补肾益精，茯苓、白术、人参、稻米健牌益气、补气生血，鲜牛乳温中补虚，砂仁、小茴香温中行气，地黄、天冬、食盐养阴凉血，黄芩清热燥湿止带，酸枣仁养血宁心安神，共为佐药；甘草调和诸药，为其使药，诸药共奏，以达疏肝解郁、养血调经之功效。现代研究表明，七制香附丸对子宫肌瘤[2]、产后便秘[3]、卵巢囊肿气滞血瘀证[4-5]、输卵管阻塞性不孕[6]等病症临床疗效显著。现行质量标准仅对七制香附丸方中臣药白芍所含芍药苷进行定量控制，中药复方制剂所含成分复杂，各成分之间相互协调、相互制约，单一成分难以全面评价七制香附丸的整体质量，文献报道中也仅对该制剂所含1～2个成分进行定量测定研究[7-9]。本实验参考中药质量标志物确定原则，选取七制香附丸方中君药醋香附所含主要化学成分香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮，臣药白芍所含活性成分芍药内酯苷和芍药苷，佐药山茱萸所含活性成分莫诺苷和马钱苷为检测指标，采用HPLC梯度洗脱法同时测定七制香附丸中7种成分含量，为七制香附丸的质量标准提升和全面评价提供数据支持。

1 仪器与试药

e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；BS110S型电子分析天平(德国Sartorious公司)。

对照品莫诺苷(批号：111998-201703，纯度：97.4%)、芍药苷(批号：110736-201943，纯度：95.1%)、马钱苷(批号：111640-201808，纯度：99.0%)、α-香附酮(批号：110748-201815，纯度：99.7%)均来源于中国食品药品检定研究院；对照品圆柚酮(批号：PRF8072622，纯度：97.5%)购于成都普瑞法科技开发有限公司；对照品芍药内酯苷(批号：18040323，纯度：98.5%)、香附烯酮(批号：18051522，纯度：95.5%)均来源于上海同田生物技术股份有限公司；乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯；七制香附丸(批号分别为181117、190102、190305)来源于河南润弘本草制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1对照品储备液 精密称取对照品莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮各适量，用75%甲醇溶液制成含莫诺苷0.298 mg·mL-1、马钱苷0.152 mg·mL-1、芍药内酯苷0.334 mg·mL-1、芍药苷0.718 mg·mL-1、香附烯酮2.476 mg·mL-1、圆柚酮0.542 mg·mL-1、α-香附酮1.318 mg·mL-1的7种对照品储备储备液。

2.1.2混合对照品溶液 精密量取上述对照品储备液各2.5 mL，用75%甲醇制成含莫诺苷14.9 μg·mL-1、马钱苷7.6 μg·mL-1、芍药内酯苷16.7 μg·mL-1、芍药苷35.9 μg·mL-1、香附烯酮123.8 μg·mL-1、圆柚酮27.1 μg·mL-1、α-香附酮65.9 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3七制香附丸供试品溶液和阴性样品溶液 取七制香附丸细粉约2.0 g，精密称定，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，加热回流提取60 min，擦干外壁，放冷，再称质量，用75%甲醇溶液补足减失质量，摇匀，滤过，即得七制香附丸供试品溶液。按七制香附丸的处方工艺，分别制备缺山茱萸、缺白芍和缺香附的阴性样品，再按上述方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及专属性试验

色谱柱：Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长：240 nm[10-12]；以乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～10.0 min，9.0%A；10.0～22.0 min，9.0%～16.0%A；22.0～37.0 min，16.0%～21.0%A；37.0～61.0 min，21.0%～45.0%A；61.0～70.0 min，45.0%～9.0%A)；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。取2.1.2～2.1.3项下溶液各10 μL进样检测，结果表明，七制香附丸供试品色谱图基线平稳，莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮峰形对称，分离度>1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均大于等于4000，阴性样品对七制香附丸中莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮7种成分的同时测定无干扰，色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.七制香附丸；C.山茱萸阴性样品；D.白芍阴性样品；E.香附阴性样品；1.莫诺苷；2.马钱苷；3.芍药内酯苷；4.芍药苷；5.香附烯酮；6.圆柚酮；7.α-香附酮 。图1 七制香附丸混合对照品、样品及阴性样品HPLC图

2.3 标准曲线及线性范围

分别精密吸取2.1.1项下对照品储备液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用75%甲醇溶液制成6个含莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮25倍质量浓度梯度的混合对照品溶液，依法进样检测，以质量浓度(X)为横坐标，莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的峰面积(Y)为纵坐标进行回归，结果见表1。

表1 七制香附丸中7种成分的线性关系考察结果

2.4 精密度考察

取2.1.2项下混合对照品溶液连续进样6次，测得莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮峰面积的RSD分别为1.11%、1.26%、0.98%、0.72%、0.53%、0.84%和0.67%。

2.5 重复性考察

取同一批次(批号：181117)七制香附丸样品适量，平行制备6份七制香附丸供试品溶液，依法进样测定，记录莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的峰面积，计算各成分含量，结果各成分含量的RSD分别为1.63%、0.85%、1.46%、1.17%、0.94%、1.47%和1.21%。

2.6 稳定性考察

取同一批次(批号：181117)七制香附丸样品适量，临用新配1份七制香附丸供试品溶液，分别于0、2、4、8、10、12 h分别进样检测，记录莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的峰面积，结果七制香附丸供试品溶液12 h内稳定，各成分峰面积的RSD分别为1.09%、1.24%、0.95%、0.70%、0.56%、0.82%和0.65%。

2.7 回收率试验

取同一批次(批号：181117)已知成分含量的七制香附丸细粉9份，每份1.0 g，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液(莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮质量浓度分别为0.087、0.043、0.125、0.259、0.896、0.155、0.447 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，使莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮对照品加入量约为样品原有量的50%、100%和150%，再按上述方法制成加样供试品溶液，依法进样测定莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的峰面积，计算各成分的加样回收率及RSD，结果见表2。

2.8 七制香附丸中7种化学成分含量测定

取3批七制香附丸样品适量，按2.1.3项下方法每个批次平行制备3份供试品溶液，依法进样测定莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的峰面积，计算七制香附丸中7种化学成分的含量，结果见表3。

表2 七制香附丸中7种成分的加样回收率试验结果(n=9)

续表2

表3 七制香附丸中7种成分的含量(n=3) mg·g-1

3 讨论

3.1 流动相的选择

根据七制香附丸中待测化学成分莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的不同性质，为达到最佳的分离效果，参考相关文献，对不同流动相体系(甲醇-水[13-14]、乙腈-水[15])进行对比考察，结果乙腈-水流动相体系各成分分离效果较佳，但芍药内酯苷、莫诺苷色谱峰存在拖尾；遂在HPLC流动相的水相中加入一定量的酸(0.1%甲酸[16]、0.1%冰乙酸、0.1%磷酸[17]、0.3%磷酸[18])进行对比考察，并对流动相比例不断优化，最终确定按照正文中流动相及梯度洗脱程序对七制香附丸中莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮7种成分进行同时测定，此流动相体系下，所检测色谱图基线平稳，待测化学成分莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮分离较好，峰形对称，灵敏度高。

3.2 供试品提取方式的优化

在制备供试品溶液时，首先对提取溶剂进行考察，以七制香附丸中待测化学成分莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的综合提取率及色谱图杂质数量等为指标，参考相关文献对比了提取溶剂(甲醇[12-15]、75%甲醇[16]、50%甲醇[17]、95%乙醇、75%乙醇[10-11])对考察指标的影响，结果以75%甲醇为提取溶剂时，莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮的综合提取率最佳；遂又分别对提取方式(超声提取法[12-14，16-18]、加热回流法[11])进行考察，结果显示，加热回流提取各化学成分综合提取率明显高于超声提取结果，可能与七制香附丸中7种待测目标成分莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮来源药材醋香附、白芍、山茱萸直接细粉入药的生产工艺有关，同时对提取时间不断摸索，最终选择75%甲醇溶液加热回流提取60 min对七制香附丸供试品进行制备。

本研究首次采用HPLC梯度洗脱法对七制香附丸中莫诺苷、马钱苷、芍药内酯苷、芍药苷、香附烯酮、圆柚酮和α-香附酮含量进行同时测定，所建立的方法操作便捷、结果准确、重复性好，为更全面地评价七制香附丸的产品质量，不断提升七制香附丸的质量控制标准提供参考。