抗sp100抗体在原发性胆汁性胆管炎中的研究进展*

徐婧，邱方，李丽，刘向东

(1. 东南大学附属中大医院检验科，南京 210009；2. 南京医科大学第四附属医院检验科，南京 210009；3. 东南大学生命科学研究院，南京 210009)

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)旧称原发性胆汁性肝硬化，是一类好发于中老年女性的慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病。PBC发病机制尚未明确，目前认为是遗传因素和环境诱因(吸烟、细菌感染、化妆品等)交互作用的结果[1]。多国的流行病学调查显示，PBC的患病率和年发病率分别为1.91/10万～40.2/10万和0.33/10万～5.8/10万[2]。在PBC患者中常见血清碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)进行性升高和特异性自身抗体抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody, AMA)阳性[3]。此外，有50%的PBC患者出现抗核抗体(antinuclear antibody, ANA)阳性，其中约1/3的ANA荧光核型为核点型或核膜型，对应的靶抗原主要包括斑点蛋白100(speckled protein 100, sp100)、核孔蛋白210(nucleoporin 210, gp210)、核孔蛋白62(nucleoporin p62, p62)、早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)、类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier, SUMO)1/2/3，是AMA阴性且有胆汁淤积表现患者确诊为PBC的一个重要依据[2]。PBC特异性ANA还与疾病的严重程度相关，对疾病预后判断有一定的临床价值[3-4]。本文就PBC特异性ANA的主要亚型抗sp100抗体的特性、临床意义和相关作用研究进行综述。

1 抗sp100抗体的产生和在PBC中作用机制研究

1.1细菌感染在抗sp100抗体产生中的作用 目前认为细菌感染是PBC致病的重要诱因之一。大范围的流行病学调查研究显示，与其他慢性肝病或自身免疫病患者相比，女性PBC患者存在高比例的反复尿路感染，致病菌种主要为大肠埃希菌[5]。有研究发现大肠埃希菌PDC-E2与人类PDC-E2的分子结构高度相似，大肠埃希菌可通过分子拟态和交叉反应等机制打破人体对自身PDC-E2抗原的免疫耐受，导致PBC发生[6]。早期有研究还发现抗sp100抗体阳性与重复性尿路感染相关，而抗gp210抗体的产生与尿道感染不相关[7]。近年来，Haruta等[8]通过使用不同的链霉菌诱导构建PBC小鼠模型，发现部分PBC模型小鼠不产生AMA，但能检测出抗gp210抗体和其他多核点型ANA，很可能包含抗sp100抗体。这些结果均提示抗sp100抗体的产生与PBC患者的细菌感染有关，但其具体机制尚无相关研究。

1.2遗传易感性在抗sp100抗体产生中的作用 一系列针对不同人种的大规模PBC全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)均证实遗传易感性在PBC的发病中发挥着至关重要的作用[9]。一项来自欧美白人的GWAS数据分析表明，不同的HLA类型可能会产生不同的免疫表型，HLA-DPB1基因上的单核苷酸多态性位点与抗sp100抗体阳性PBC患者相关[10]。本课题组对中国汉族PBC患者的PBC特异性ANA亚型的GWAS研究结果表明，主要组织相容性复合体区域的rs1794280和rs492899位点与抗sp100抗体相关联，并鉴定出HLA DRβ1-Asn77/Arg74、DRβ1-Ser37、DPβ1-Lys65是决定抗sp100抗体产生的关键位点[11]。这些研究结果揭示，抗sp100抗体具有强烈的遗传倾向，为相关致病机制的研究和治疗提供新的线索。

1.3抗sp100抗体识别模式变化在PBC发病过程中的作用 随着PBC病情的进展，患者血清中的抗sp100抗体表位识别模式和抗体类型可有变化。Züchner等[12]采用ELISA法对170名PBC患者抗sp100抗体变化进行2年的跟踪研究，结果显示未发生患者抗sp100抗体阴性转阳性或阳性转阴性的情况；但使用重组全长sp100蛋白(Sp-FL)和重组sp100蛋白片段(Sp-AB、Sp-CD、Sp-DF、Sp-GH和Sp-26)检测其中9位PBC患者的系列样本(0个月，12个月，24个月)的抗sp100抗体，发现2位患者不同时期的血清与靶抗原反应性出现变化：其中1位患者在12个月和24个月血清中新增和GH蛋白片段的反应性，而在0个月血清中并未出现；另1位患者在0个月和12个月血清和CD蛋白片段呈强反应性，而在24个月血清中则明显减弱；进一步结合这9名患者的检测和治疗信息分析，推测在PBC疾病自然进程中患者血清中抗sp100抗体能够出现抗体表位识别模式的改变，且该过程可能由熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)治疗过程诱发或加速。Mytilinaiou等[13]针对52位PBC患者进行长达5年的随访，采用线性免疫印迹法检测这些患者的序列样本的抗sp100抗体，结果发现随访初期有17位患者抗sp100抗体阳性，随访末期仅有13位患者抗sp100抗体阳性，有1位患者出现抗sp100抗体阴性转阳性，5位患者抗sp100抗体阳性转阴性，其余12位患者抗sp100抗体阳性结果无改变，提示多数PBC患者未出现抗体类型的改变。对抗sp100抗体表位识别模式或抗体类型改变的进一步研究将有助于明确抗体的产生原因及其在发病过程中的作用，揭示PBC的潜在致病机制。

2 抗sp100抗体检测方法

1987年，Szostecki等[14]采用免疫荧光法对一组自身免疫病患者血清进行分析，发现在Hep2细胞中呈现典型的核点型荧光模式，并通过Hela细胞核中可溶性蛋白片段的免疫印迹试验和亲和纯化sp100特异性自身抗体的免疫荧光试验证实所有血清的共同抗原靶蛋白为可溶性酸性磷酸化核蛋白sp100。随后，该团队对sp100抗原和抗sp100抗体进行一系列研究，利用抗sp100自身抗体血清在λ gt11 cDNA表达文库筛选并表达含sp100主要抗原位点的sp26蛋白片段，并采用以sp26重组蛋白为靶抗原的ELISA分析在184名PBC患者血清中发现有50名检出抗sp100抗体阳性；进一步应用肽段分析方法研究PBC疾病相关的sp100抗原表位，发现PBC患者的抗sp100抗体多数能够至少识别sp-AB(aa1-253)、sp-D(aa282-334)及sp-EH(aa333-474)3个非重叠片段，并提示sp100主要抗原表位位于蛋白C端[15]。Blüthner等[16]则通过噬菌体展示技术确定sp100的2个主要线性表位及其核心片段分别是SNSKVE(aa303-308)和EPLEVFISA(aa339-347)。上述2个团队关于sp100抗原表位研究结果不尽相同，我们认为肽段分析方法中使用的大片段有可能遮蔽重要的表位，而噬菌体展示技术需要已有的抗体筛选出具体相关表位，在检测患者样本中的多样性抗体时可能存在一定的局限性。

目前较为广泛用于检测抗sp100抗体的方法主要为间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence，IIF)[17]、ELISA[18-19]、免疫印迹法[20]等。一项研究用ELISA技术和IIF 2种方法对PBC患者的抗sp100抗体进行检测，结果发现ELISA方法和IIF方法对抗sp100抗体的检测特异性分别为99%及98%，敏感性分别为44%和34%[17]。IIF方法在检测ANA核型过程中对核型分类具有一定的价值，但不能给出准确的定量结果，并且涉及人为的主观判断。而ELISA方法灵敏度高，更具性价比，适合用于临床样本的大批量检测。目前，国内医院常将抗sp100抗体作为自身免疫性肝病抗体谱的筛查项目之一，采用免疫印迹法检测，已有的研究结果显示其具有高特异性[20]。张海萍等[21]采用3种不同的免疫方法，包括化学发光免疫分析法(chemiluminescence analysis，CLIA)、免疫印迹法和ELISA法，针对抗sp100抗体开展检测，结果发现不同方法的检测结果具有基本相当的检测性能和良好的一致性。CLIA有着精确定量、检测线性范围宽等优势，有望在未来的抗sp100抗体检测中得到普及。

3 PBC中抗sp100抗体的临床价值

3.1抗sp100抗体在PBC诊断和预后中的意义 抗sp100抗体在PBC诊断中存在高特异性和较低的敏感性，但值得关注的是AMA阴性患者的抗sp100抗体阳性检出率要高于AMA阳性患者[11,17]。鉴于抗sp100抗体对PBC尤其是AMA阴性PBC有重要的诊断价值，美国肝病研究学会和欧洲肝病研究协会在新版的原发性胆汁性胆管炎实践指南中均提出，在AMA阴性情况下，其他PBC特异性抗体(包括抗sp100抗体或抗gp210抗体)阳性可作为PBC的诊断标准之一[3,22]。

目前，关于抗sp100抗体作为PBC预后预测指标的价值尚未有统一结论。早期欧美白人用ELISA法对PBC患者进行抗体检测，临床相关性分析结果显示抗sp100抗体阳性和阴性患者的年龄、性别、组织学分期、生化和免疫球蛋白指标方面差异均无统计学意义，且对UDCA治疗效果影响不大。但随访研究发现核点型抗体阳性患者比阴性患者更容易进展到组织学晚期，提示抗sp100抗体与不良预后可能有一定关联[12]。Mytilinaiou等[13]采用免疫印迹法对52名PBC患者(共采集352个系列样本)进行2～10年期的抗sp100抗体的动态变化跟踪研究，结果显示抗sp100抗体水平和用于PBC疾病预后预测的梅奥风险评分显著正相关，抗sp100抗体阳性较阴性患者的病情更为严重，发病时间更年轻、病程更长。Hu等[19]用ELISA法对198名PBC患者进行抗体谱分析，结果发现抗sp100抗体阳性与肝脏相关生化指标变化无关。近年，Yang等[20]采用免疫印迹法对276名汉族PBC患者进行抗体检测，结合患者的临床数据，应用多个PBC预后模型进行风险预测研究，结果显示抗sp100抗体阳性和阴性的PBC患者的5年不良后果生存率差异并无统计学意义。

3.2抗sp100抗体在PBC病情监测和治疗中的价值 抗sp100抗体效价水平与PBC疾病进展及严重程度的关系还存在着一定的争议。Gatselis等[18]对14名抗sp100抗体阳性PBC患者进行3年期的随访，系列血清样本的ELISA法检测结果显示抗sp100抗体的效价降低与梅奥风险评分的改善和UDCA应答相关。而Tana等[23]对27名PBC患者进行长达约20年的随访，系列血清样本的ELISA法检测结果表明，有6名抗sp100抗体阳性患者的抗体效价水平随着时间产生显著变化，且抗体效价水平的降低与肝活检组织的纤维化程度增高相关。尽管以上结果看似矛盾，但均提示抗sp100抗体效价变化可预示PBC的病情变化，将有助于对PBC的病程监测。

近期Beattie团队采用免疫印迹法检测抗sp100抗体，研究其对UDCA应答反应影响，结果显示，抗sp100抗体阳性与阴性PBC患者间UDCA治疗的应答率差异无统计学意义[24]，该结果提示抗sp100抗体在PBC患者的UDCA治疗中指导作用有限。

4 总结和展望

特定的遗传易感位点和反复尿路感染因素可能对抗sp100抗体的产生起着重要作用，然而发生作用及参与PBC发病的机制仍有待进一步的研究。病程中抗sp100抗体类型或表位识别模式有改变，提示抗sp100抗体存在较为独特的产生机制和致病原因。抗sp100抗体对AMA阴性PBC确诊有重要的价值，不仅可减少不必要的肝组织活检，还可帮助患者早诊断、早治疗，进而有效延缓疾病进程，降低晚期肝纤维化甚至肝硬化风险。

目前，临床上常用的抗sp100抗体的检测方法多为定性分析，如免疫印迹法、ELISA、IIF等，尚无法实现抗体水平变化的动态监测。其主要原因为目前没有相应的参考物质或标准品，这导致抗sp100抗体的不同检测方法和不同品牌试剂的检测结果欠缺可比性，也是不同PBC患者的研究分析中存在不同研究结论的可能原因。随着化学发光和荧光定量检测方法的发展和标准品的研发，监测其水平在疾病发生发展和药物治疗中的动态变化，将有助于明确抗sp100抗体水平变化对病情活动度和药物疗效的临床价值。