多组学技术在奶牛瘤胃微生物与宿主互作机制中的研究进展
2021-03-31沈义媛童津津熊本海蒋林树
沈义媛,童津津,熊本海,蒋林树*
1 北京农学院动物科学技术学院;奶牛营养学北京市重点实验室,北京 102206
2 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193
0 引言
瘤胃是反刍动物重要的生物反应容器,在其中包含了大量的微生物,包括细菌、古菌、真菌和原生动物等[1]。在成年反刍动物中,瘤胃是饲料降解和营养吸收的主要场所。尽管新生犊牛的瘤胃体积、吸收能力和物质代谢方面并不发达[2],但是有研究表明,在幼龄反刍动物的瘤胃中,微生物的组成及结构对成年后奶牛的瘤胃发育和生理功能有着重要的影响[3]。此外,奶牛的饲料效率很大程度上受微生物从饲料中提取能量的能力,以及产生微生物蛋白质作为宿主蛋白质来源的能力的影响[4]。因此,对瘤胃微生物的定性定量分析对于奶牛健康的维持和改善其生产性能有着重要的意义。
1 瘤胃微生物的影响因素
1.1 热应激
热应激是降低奶牛饲料利用率,影响奶牛生产性能的重要因素之一。据研究,荷斯坦牛产热能力强但散热能力有限[5],特别是在高温高湿的环境中,极易产生热应激。研究表明,热应激发生时,奶牛瘤胃上皮细胞间的紧密连接结构被破坏。此时,瘤胃黏膜屏障功能受损、通透性增加[6],奶牛瘤胃内微生物的组成和代谢物发生显著变化。Kim等[7]的研究表明,在正常情况下,荷斯坦牛瘤胃中唯一的优势菌群是瘤胃球菌科细菌,但在热应激条件下,纤维杆菌在瘤胃中显著富集。相对应的,泽西奶牛瘤胃中原本的优势菌群为放线菌门、红蝽菌纲等,然而在热应激条件下,优势菌群发生改变,梭杆菌门、软壁菌门、蓝细菌等成为优势菌群。虽然这两种奶牛在相同饮食条件下瘤胃微生物组成不同,但在热应激发生时瘤胃微生物结构都发生了很大的变化。Zhao等[8]对18 头荷斯坦牛进行瘤胃内容物的基因测序分析,结果表明,在发生热应激奶牛的瘤胃中,链球菌、瘤胃杆菌、密螺旋体、未分类的拟杆菌科等细菌的相对丰度显著提高,其中,作为瘤胃中产乳酸的主要菌属——链球菌数量的增加使得瘤胃中乳酸水平升高,pH值降低,进而抑制对pH敏感的瘤胃细菌,如纤维素分解菌的生长。据报道,在热应激条件下,奶牛的采食量降低,此时瘤胃乳头宽度、周长和表面积均减小[9],因此,瘤胃微生物在热应激条件下的改变,可能与瘤胃组织形态的变化具有一定相关性。此外,热应激还可能通过提高瘤胃温度、降低瘤胃液pH和渗透压来改变瘤胃内菌群的结构和数量[10]。总而言之,热应激可通过降低奶牛采食量、改变瘤胃内环境和组织结构等途径影响瘤胃内微生物的组成,继而调控奶牛的生产性能。
1.2 饲养管理
科学合理的养殖方式不仅能够为奶牛创造舒适的环境,还能够维持奶牛瘤胃内微生物的稳态,降低疾病发生率,提高奶牛的生产性能。为有效缓解奶牛在夏季多发的热应激,在实际生产中,牛场可通过安装遮阳设施,并在牛舍内设置风扇和喷淋装置达到及时降温的效果[11]。此外,合理的饲料搭配对于维持瘤胃微生物结构的稳态也非常重要。Vaidyaj等[12]的研究表明,与饲喂牧草青贮相比,饲喂玉米青贮可显著降低奶牛瘤胃产甲烷菌的活性,增加瘤胃中普雷沃氏菌属、反刍球菌科和琥珀酸弧菌科等细菌的丰度,并有利于丙酸的产生,为奶牛泌乳提供更多的能量。此外,真细菌属丰度的增加可提高氨基酸的合成效率,继而提高乳蛋白质含量,该研究充分证明了玉米青贮在改善瘤胃微生物结构,提高奶牛泌乳性能上的巨大优势。徐晓峰[13]等测定了在不同精粗比饲粮条件下,泌乳奶牛瘤胃内菌群结构的变化,结果表明,低精料组的菌群多样性和丰富度显著高于高精料组。其中,厚壁菌门、丁酸弧菌属、纤维杆菌属、瘤胃球菌属等与纤维降解有关的菌群在低精料组中显著高于高精料组;反之,密螺旋菌属等产酸菌在高精料组中丰度较高,证明不同精粗料比对瘤胃微生物的结构起着重要的作用。因此,奶牛的管理策略和日粮营养组成对瘤胃微生物的组成具有决定性的作用,为从瘤胃微生物的角度调节动物健康提供了思路。
1.3 饲料添加剂
近年来,使用饲料添加剂调节反刍动物瘤胃微生物组成,维持瘤胃健康,越来越受到广泛关注。特别是各类植物提取物及微生态制剂在实际生产中最为流行。据报道,汪悦等[14]向4 头瘘管荷斯坦牛投喂不同剂量的皂甙,并采集瘤胃液进行测定,结果表明,皂甙的添加量越多,原虫的抑制效果越明显,此外,瘤胃中的产甲烷菌,如甲酸甲烷杆菌、史氏甲烷杆菌数量显著降低,为调节奶牛甲烷排放量,提高生产性能提供了依据。Kasparovska等[15]将12 头泌乳奶牛分为两组,在试验组的基础饲粮中补充了12.5 g含40%有效成分的异黄酮提取物,14 天后对瘤胃微生物组进行16 s rRNA测序。结果显示,异黄酮与未分类的β-蛋白杆菌和伯克霍尔德氏菌呈正相关,反之,与瘤胃球菌科、韦荣球菌科呈负相关,瘤胃中挥发性脂肪酸(VFA)和瘤胃球蛋白增加,证明异黄酮提取物可以通过影响瘤胃微生物的菌群结构而显著提高奶牛饲料利用率。此外,益生菌作为一种微生态制剂,在改善胃肠道菌群,提高奶牛免疫力和营养消化率等方面具有巨大的潜力[16]。据报道,Fomenky等[17]在犊牛饮食中添加两种直接饲喂微生物(DFM)——酿酒酵母和嗜酸乳杆菌,结果发现这两种益生菌均显著减少了瘤胃中潜在的病原细菌链球菌属的数量,并增加了纤维杆菌等有益细菌的数量。因此,饲料添加剂在预防奶牛疾病、减少甲烷排放量、增加产奶量、提高生产性能等方面具有广泛的应用前景。
2 多组学分析技术在奶牛瘤胃微生物中的研究进展
随着分子生物学技术的发展,组学技术作为一种功能强大的定量定性分析技术,在奶牛生产、营养及疾病等方面的应用越来越广泛。目前,常见的组学技术包括宏基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等[18],各组学技术因其灵敏性、准确性及系统性等优点,在瘤胃微生物组成结构及其功能的分析中表现出了巨大的优势。此外,组学技术可通过分析奶牛瘤胃微生物组成结构和功能、微生物代谢产物和代谢途径,以及微生物对宿主饲料利用率的影响,精准调控奶牛的饮食结构,为降低甲烷排放量、提高奶牛的生产性能提供了科学的依据。
2.1 16s/宏基因组
16s rRNA高通量测序技术主要是对微生物基因组rRNA上的保守序列测序并进行物种鉴定,随着生物技术的不断完善,16s rRNA基因检测技术已成为检测和鉴定瘤胃微生物的一种强有力工具[19]。Jami等[3]采集4 个不同年龄段荷斯坦牛的瘤胃DNA样品,并对16s rRNA基因进行扩增测序,证明了在不同年龄段,厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门都是瘤胃中的优势菌种,但相对丰度及菌属存在显著差异。Tong等[20]将16 头胎次相近的荷斯坦牛,平均分为高产组和低产组,对奶牛瘤胃微生物进行16s rRNA高通量测序分析,结果表明,在相同日粮条件下,高产奶牛的产奶量高于低产奶牛,主要归因于高产奶牛中拟杆菌属、瘤胃球菌属、毛螺菌科、真细菌和纺锤状细菌属的含量较高。Zhong等[21]对四组不同水平体细胞数(SCC)的荷斯坦牛的瘤胃样品进行16s rRNA高通量测序分析,结果表明高SCC奶牛的瘤胃内微生物α多样性指数的Shannon指数显著较高,而Simpson指数显著较低。在门水平上,SR1和放线杆菌在4 个组中存在显著差异;在属水平上,梭菌目、S24-7和RF16中3 个未分类的属在4 个组奶牛中存在显著差异。因此,16s rRNA高通量测序技术可全面解析奶牛的瘤胃微生物区系变化,为进一步探究瘤胃微生物和宿主之间的相互关系奠定了基础。
宏基因组主要以微生物全部基因组为研究对象,与16s rRNA高通量测序技术相比,具有更高的覆盖率,可以更加准确地反映瘤胃微生物组的结构和核心功能[22],极大程度地提高了物种鉴定的精确度和测序数据的总量[23]。Delgado等[24]采集了80 头荷斯坦牛的瘤胃液,经宏基因组测序后发现,饲料效率最高的奶牛瘤胃中丁酸弧菌和普氏杆菌的相对丰度较高,而厚壁菌门丰度较低;此外,甲烷杆菌和甲烷短杆菌的丰度较低,这说明了高产奶牛能更加有效地利用饲料中的蛋白质和碳水化合物,降低甲烷排放量,提高产奶量。吴建民等[25]人选用乳蛋白含量长期较高与较低的荷斯坦牛各3 头,采集瘤胃内容物并通过宏基因组学测定瘤胃微生物菌群结构的差异。结果发现,拟杆菌门、普雷沃氏菌属等菌群的相对丰度在两组奶牛之间呈现出显著差异,并且首次发现三角酵母属可能对调节乳蛋白含量具有一定作用。此外,高乳蛋白含量组奶牛表达半胱氨酸与蛋氨酸代谢和其他氨基酸代谢功能基因的相对丰度显著高于低乳蛋白含量组奶牛,为进一步解析奶牛乳蛋白合成机制提供了新的见解。值的注意的是,Shinkai等[26]在瘘管奶牛的瘤胃微生物宏基因组中,发现了大量纤维素酶编码基因家族,其中糖苷水解酶9、11、30、43,碳水化合物酯酶8和碳水化合物结合模块6是特征性编码基因家族,这为进一步解析瘤胃发酵机理提供了新思路。因此,宏基因组测序技术不仅可以通过数据库比较不同饮食及生理状况下奶牛瘤胃微生物的差异性,还可以检测到微生物的功能性基因。此外,目前已有研究将瘤胃中关键的纤维降解酶应用于工业生产[27],这对于瘤胃微生物进一步的开发和利用具有重要的意义。
2.2 代谢组学
代谢组学是利用核磁共振、液相色谱/质谱(LC/MS)、气相色谱-飞行时间/质谱(GCTOFMS)等高通量技术对生物样品中的内源性代谢物进行定量分析的一种评价方法[28],运用代谢组学技术可以清晰直观地检测到机体代谢通路和代谢物的变化。Zhang等[29]人采集了荷斯坦牛(高产组和低产组)瘤胃液样品,通过液相色谱/质谱(LC/MS)代谢组学方法分析,在高低产两组奶牛的瘤胃液中共鉴定出54 种差异显著的代谢产物,富集到13 条主要代谢途径。其中,蛋白质的消化吸收、ABC转运蛋白和不饱和脂肪酸的生物合成是3 条差异最为显著的代谢途径。此外,几种代谢产物与特定的瘤胃菌群有很大的相关性,例如厚壁菌门与脂肪酰基呈显著负相关;拟杆菌门与D-木糖呈显著负相关等,这些标志性代谢物与瘤胃微生物菌群组成及其结构存在指示作用,而对于这些潜在生物标志物进行进一步研究,必将为解析高低产奶牛泌乳机制的研究提供新见解。同样的,Mu等[30]使用液相色谱-质谱(LC-MS)代谢组学测定了高低产奶牛的瘤胃微生物,结果共鉴定出92 种差异微生物代谢物。其中,高产奶牛瘤胃液代谢物丰度的增加与不饱和脂肪酸的生物合成、类固醇的生物合成、泛醌和其他萜类-醌的生物合成等代谢途径有关,证明高产奶牛在机体供能效率上优于低产奶牛。Shabat[31]等通过气相色谱-质谱法,测定了不同剩余采食量(RFI)奶牛的瘤胃液,结果发现,丙酸、丁酸、戊酸和异戊酸的浓度在高效奶牛的瘤胃中较高,特别是丙酸和丁酸在生成过程中可能与甲烷竞争氢气,降低了高效奶牛的甲烷排放量。值得注意的是,京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径富集分析结果表明,富含在低效奶牛微生物群中的差异代谢物主要是蛋白质消化和吸收、氨基酸生物合成和甲烷代谢类酶,这进一步解释了低效奶牛的瘤胃发酵特征及其调控机制。综上所述,代谢组学不仅可直观揭示奶牛的微生物代谢物及其代谢途径的差异,还为进一步改善奶牛饮食,调控代谢途径,提高奶牛生产性能提供了参考。
2.3 多组学联合
如今,多组学联合分析技术解析瘤胃微生物的菌群结构及功能越来越全面且深入。Malmuthuge等[32]联合瘤胃宏基因组和宿主转录组分析方法,探究了新生犊牛瘤胃微生物组成及其对早期瘤胃发育的影响。结果表明普雷沃氏菌、链球菌属、梭状芽胞杆菌属、瘤胃球菌属等菌属在瘤胃中占主导地位,并与瘤胃上皮形态发生、蛋白质定位和转运等功能显著相关。此外,犊牛瘤胃中高度异质性和低丰度的古菌,意味着可通过早期饲养策略改变瘤胃产甲烷菌从而增强微生物发酵和减少瘤胃中的甲烷生成的可能性。Xue等[33]对20 头泌乳中期奶牛进行瘤胃宏基因组和代谢组学等多组学分析,来解析高乳蛋白产量(Milk Protein Yield,MPY)奶牛的特征。结果显示,高MPY奶牛瘤胃中的普雷沃氏菌物种丰度较高,有助于改善支链氨基酸生物合成的功能,为宿主合成乳蛋白提供了充足的瘤胃微生物蛋白。此外,黄色瘤胃球菌和反刍硒单胞菌在高MPY奶牛瘤胃中的高丰度结果表明,这两种细菌可能是奶牛瘤胃丙酸含量升高的主要原因;与之相反,瘤胃中产甲烷菌的相对丰度较低,表明MPY奶牛产甲烷量较低,导致碳水化合物合成的酶和途径高于低MPY奶牛,从而提高了饲料转化率。这种微生物群和宿主代谢的关联分析,为通过饲养管理或遗传选择改变瘤胃微生物区系以提高牛奶质量和产量的策略提供了新见解。Sun等[34]将奶牛饲粮中的高质量苜蓿干草替换为低质量玉米秸秆,并通过宏基因组学、代谢组学及转录组学探究奶牛瘤胃微生物和乳品质的变化。结果表明,在饲喂玉米秸秆时,瘤胃中变形杆菌门、纤维杆菌门和黏胶球形菌门的相对丰度显著高于对照组,而密螺旋体和琥珀酸单胞菌在瘤胃中的相对丰度较低,导致瘤胃中丙酸含量降低、乙酸含量显著上升。进一步的研究表明,奶牛血液中氨基酸代谢组的丰度较低,同时酪蛋白编码基因CSN3和CSN1S2下调,导致乳腺中蛋白质加工和合成减少。这项研究为提高农作物副产品利用率、反刍动物可持续生产提供了新的认识和潜在的改进策略。总而言之,多组学联合应用分析可以得到更加丰富的数据,对宿主整体变化进行综合分析,获得更加可靠的结果,是动物营养科学理论和技术体系创新和发展的新趋势。
3 奶牛瘤胃微生物与机体健康的互作关系
瘤胃微生物群落对于反刍动物的健康和实际生产具有重要意义,但是,这种复杂的微生物生态系统一旦失调,会对宿主造成严重的后果[35]。组学技术不仅在瘤胃微生物组成和数量的测定中运用广泛,在疾病的预防和治疗方面也有着显著的优势。
3.1 瘤胃酸中毒
瘤胃酸中毒(SARA)是奶牛生产中常见的健康问题,这种疾病是由高淀粉饲料的增加引起的。据报道,当瘤胃微生物群落在短时间内暴露于大量高度发酵的底物时,VFA的产生速率将超过VFA的吸收速率,此时VFA在瘤胃中积聚并显著降低瘤胃pH值,导致瘤胃酸中毒[36]。Plaizier等[37]建立了2 种瘤胃酸中毒的营养模型,并使用16s rRNA基因高通量测序技术测定了SARA对荷斯坦牛瘤胃微生物的影响,结果两种模型都降低了瘤胃中细菌的丰度和多样性。其中,拟杆菌门、SR1细菌的丰度显著降低,而厚壁菌门的丰度显著上升,证明在SARA条件下,瘤胃菌群发生了显著的变化。值得注意的是,厚壁菌门和拟杆菌门的比例与饲料效率、产奶量和乳脂产量密切相关,表明SARA对奶牛的生产性能有着重要的影响。先前的研究表明[38],低pH值的瘤胃环境一方面导致瘤胃内微生物紊乱,如革兰氏阴性菌大量死亡溶解;另一方面则会损伤瘤胃上皮,导致游离脂多糖(LPS)等有害物质入血,机体发生系统性炎症反应。Li等[39]饲喂1~16 周龄犊牛高淀粉饲料来诱导瘤胃酸中毒,在17 周龄时收集犊牛的瘤胃上皮组织并对微生物群落进行转录组分析。结果发现试验组中有14 个属的丰度显著高于对照组,其中欧氏菌属和脱硫弧菌显示出4 倍的增加。此外,与细胞信号和形态发生等生物途径相关的差异表达基因在试验组中显著富集,证明瘤胃微生物主要通过影响肌动蛋白细胞骨架改变瘤胃上皮的结构。此时,试验组犊牛瘤胃上皮发生溃疡,各种机会致病菌如坏死梭形杆菌(F.necrophorum)通过瘤胃上皮进入血液,继而引起乳腺炎等全身炎症反应。综上所述,瘤胃酸中毒对瘤胃微生物的组成和功能有着显著的影响,通过多组学技术测定生物标志物进行瘤胃酸中毒的早期预测对于调整饲粮结构,提高奶牛的生产效率具有重要的意义。
3.2 乳腺炎
奶牛乳腺炎是由多种微生物(细菌、真菌和病毒等)引起的一种乳腺疾病,当大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌侵染奶牛乳腺组织并引发乳腺炎时,乳腺组织中的细胞发生凋亡,继而引起机体的炎症反应。多项研究表明[40~42],在奶牛的乳房内注射LPS可引起乳腺炎的临床症状,作为疾病发生模型。Johnzon等[40]对LPS诱导的乳腺炎奶牛进行代谢组学分析,结果显示,奶牛血浆中的乳糖迅速增加,而酮体(3-羟基丁酸酯和乙酰乙酸酯)、短链脂肪酸、柠檬酸盐显著减少。因此,乳腺炎会导致奶牛乳腺上皮细胞紧密连接的破坏,肝脏功能受损,并且抑制瘤胃内短链脂肪酸的产生。此外,有研究表明,当奶牛发生SARA后,乳汁和瘤胃液的菌群结构变得更加相近,主要表现为寡养单胞菌(Stenotrophomonas)丰度的显著升高,可以推测乳腺炎和瘤胃微生物的稳态有着密切的联系[43]。值的一提的是,SARA在增加奶牛血乳屏障渗透性的同时降低了乳腺组织清除病原体的能力,加速了乳腺炎的发生[44]。为探究SARA对乳腺炎的影响,Aditya等[42]分别在健康奶牛和SARA奶牛的乳房中注射LPS,诱导乳腺炎的发生。经代谢组学分析,与健康牛相比,SARA奶牛注射了LPS之后,血清中乳酸浓度增加,β-羟基丁酸(BHBA)的浓度降低,证明SARA奶牛肝脏功能受损。此外,血清中几种急性期蛋白(APP)明显增加,表明在受到急性外源性免疫原刺激时,SARA奶牛乳腺炎症的消退比健康奶牛延缓。因此,瘤胃微生物群的稳态不仅与瘤胃健康有直接关系,对宿主整体生理状况也有着重要影响。
3.3 其他
子宫内膜炎是奶牛常见的产后疾病,最常发生在产后2 周内,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是奶牛子宫内膜炎中常见的致病细菌[45]。除了产后易患子宫内膜炎,高精料饲喂导致的瘤胃微生物紊乱也会引发子宫内膜炎。Bilal等[46]的研究发现,在奶牛发生SARA后LPS进入血液,奶牛子宫内核转录因子和促炎细胞因子的mRNA表达量丰度随之升高,NF-κB-p65及其活性磷酸化变异体蛋白表达增加,证实来自瘤胃的LPS会引发子宫炎症相关基因的表达,导致奶牛子宫内膜炎的发生。为进一步确定子宫内膜炎的发生,Miller等[47]通过蛋白组学对患有子宫内膜炎的奶牛进行检测,结果显示补体蛋白、分泌性磷蛋白24(Spp-24)、人血清淀粉样蛋白P(SAP)等蛋白在患病时显著上升,并将免疫球蛋白M样蛋白G5E513等作为子宫内膜炎的潜在生物标志物。因此,组学技术在疾病诊断和预防中具有显著的作用。
类似的,肝脓肿通常继发于瘤胃酸中毒。据报道,坏死梭杆菌是瘤胃中一种常见的革兰氏阴性菌,以乳酸为主要反应底物,在饲喂高谷物饲粮后,乳酸在奶牛瘤胃中的含量增加,此时坏死梭杆菌的数量也会随之升高,而坏死梭杆菌的血凝素、脂多糖和白细胞毒素是诱导肝实质脓肿形成的三大因素[48]。因此,当瘤胃上皮被破坏时,坏死梭杆菌从瘤胃壁内分离,使得淋巴细胞数量显著减少,继而导致肝脓肿的发生。此外,坏死性梭杆菌的内毒素和白细胞毒素被认为是突破宿主防御机制引起蹄病感染最重要的因素[49]。当奶牛感染腐蹄病时,患病奶牛趾间皮肤坏死,郑三家[50]通过代谢组学和蛋白组学对腐蹄病奶牛进行生物学检测,结果表明在患腐蹄病时,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,甘油脂代谢、糖酵解或糖异生通路等代谢途径受到显著影响,机体代谢紊乱,抗氧化应激能力降低。此外,参与机体炎症反应和免疫应答的差异表达蛋白如免疫球蛋白、纤维蛋白原和结合珠蛋白等显著上升,继而引发全身性疾病,导致重大经济损失。综上所述,瘤胃微生物组成和数量对于维持宿主机体的稳态具有至关重要的意义。
4 小结
奶牛作为一种重要的经济动物,能将低成本的饲料转化为高质量的动物蛋白,这主要归功于瘤胃微生物的发酵作用。瘤胃微生物一旦失衡,不仅会降低奶牛的生产性能,还会引发瘤胃酸中毒、乳腺炎等一系列疾病。组学作为新兴的生物技术,可以通过测定奶牛的瘤胃微生物组成、功能性基因、代谢途径及产物等方式,及时调整奶牛的饲养环境和饮食结构,达到提高生产性能、预防疾病的目的。此外,组学可以更加直观准确地体现新型饲料添加剂的实际使用效果,为绿色健康的养殖模式提供了更加广阔的思路。