弓形虫入侵宿主分子机制研究进展

张小涵，丁莹莹，马知川，杜铭怡，于克杰，桑晓宇，冯 颖，陈 冉，杨 娜

(沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866)

刚地弓形虫((ToroplasmagondiiNicolle & Manceaux)是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫，几乎可以感染包括人在内的所有温血脊椎动物，引起人兽共患弓形虫病[1]。通常情况下，大多数免疫功能健全的感染者呈无临床症状的隐性感染。然而，当弓形虫感染艾滋病患者、恶性肿瘤患者、器官移植患者等免疫系统受损的个体时，会导致严重的疾病甚至死亡。同时，弓形虫病也是新生儿在子宫内感染的疾病，也是导致妊娠期妇女流产的一个重要原因。此外，弓形虫还可在家畜及宠物间进行传播，引起患畜流产、死胎，给畜牧业带来较为严重的经济损失。由于弓形虫宿主范围广、感染率高，并可与宿主良性共存，使其成为世界上最成功的人兽共患寄生性原虫之一[2]。弓形虫病已引起医学界和畜牧行业广泛的高度重视，成为一种不容小觑的全球性公共卫生问题。虫体的入侵是弓形虫致病的一个重要环节，对其分子机制的解析有利于弓形虫病的检测方法以及相关疫苗和治疗药物的开发。

1 滑行运动与入侵

弓形虫不具备伪足、鞭毛和纤毛等运动细胞器，其运动方式与阿米巴原虫和大多数单细胞生物截然不同。弓形虫依靠一种独特的基质依赖型运动，称为滑行运动，其动力由位于质膜下方的肌动-肌球蛋白系统所提供[3]。滑行运动将弓形虫以每秒1 μm～2 μm的速度向前推进[4]，可使虫体积极主动地穿过宿主体内的多种生物屏障，快速穿透各种类型的有核细胞，以利于虫体的迁移和入侵。

1.1 滑行运动机制

滑行运动的过程是以肌动-肌球蛋白为基础的细胞骨架以及相关蛋白质的分泌和转位的协调配合来实现的[5]。肌动蛋白在真核细胞中含量丰富，以球状单体形式存在，通常情况下聚合成微丝。在弓形虫体内，肌动蛋白微丝是极具活力的，新丝的形成可能会限制运动速率[6]。利用细胞松弛素(肌动蛋白聚合抑制剂)对弓形虫的运动进行抑制的试验表明，肌动蛋白丝在弓形虫的运动中发挥关键作用[7]。弓形虫的运动性还依赖于一种叫TgMyoA的小肌球蛋白的动力，敲除编码TgMyoA的基因可使虫体失去运动性而无法入侵宿主细胞[8]，这种小肌球蛋白作为复合物的一部分锚定在内膜复合物上[9]。在弓形虫入侵宿主细胞的过程中，虫体顶端分泌的黏附素可作为跨膜蛋白聚集在虫体表面，并与宿主细胞表面的相关受体结合，以促进虫体在宿主细胞表面的固定。肌球蛋白沿着肌动蛋白丝的驱动向前滑行，引起黏附素和受体复合物后向易位，使得寄生虫沿基质方向前进并入侵宿主细胞。

1.2 滑行体的组成、装配和锚定

滑行运动是由滑行体驱动的，滑行体作为一个配置精密、高度协调的“运动机器”将虫体顶端分泌的黏附素转移到后方，以此推动弓形虫进入宿主细胞[10]。滑行体位于弓形虫的原生质膜和内膜复合物(inner membrane complex,IMC)之间，由肌球蛋白A(myosin A,MyoA)、一条肌球蛋白轻链(myosin light chain 1,MLC1)和两条必需轻链1、2(essential light chains,ELC1 and ELC2)以及滑行相关蛋白(gliding-associated protein,GAP)组成[11]。MyoA作为弓形虫运动中的发动机，其头部区域可将ATP水解释放的化学能转化为能够沿着肌动蛋白定向运动的动能[12-13]，MLCI与MyoA的颈部区域结合可发挥杠杆臂的作用将这种动能转化为运动。MLC1的保守氨基端延伸可将MyoA送到质膜内的作用部位，再通过与GAP45的结合锚定在内膜复合物上。GAP45在弓形虫胞浆中产生，其N末端通过酰化作用锚定在质膜上，而C末端则锚定在内膜复合物上[14]。在弓形虫入侵宿主细胞期间，GAP45聚集MyoA到内膜，促使MLC1-MyoA连接到内膜上，通过形成一个桥来保持运动过程中虫体表膜的完整性[15]。GAP50作为内膜复合物上一种完整的糖膜蛋白，在弓形虫滑行运动中起着不可或缺的作用[15]。MyoA、MLC1和GAP45首先组装形成一个可溶性复合物，然后通过GAP45与GAP50的衔接将MyoA-MLC1-GAP45复合物锚定到内膜复合物上[16]，此过程是由GAP45的磷酸化来完成的。同时，有研究表明GAP50的N末端糖基化也发挥了关键作用[14]。

2 弓形虫入侵宿主细胞的过程

弓形虫入侵是一个连续且复杂的过程，需要多种分泌细胞器及其相关蛋白和因子的协调配合，以一种动态机制入侵靶细胞[17]。弓形虫首先寻找合适的的靶细胞并对其细胞膜进行勘察，直至识别到合适的位点时才开始入侵。当弓形虫与宿主细胞表面接触时，虫体会伸出类锥体，随后微线体蛋白经类锥体向外分泌大量微线体蛋白来介导虫体的黏附[18]。同时，棒状体颈部蛋白开始分泌并被运输至虫体表膜。随后，微线体蛋白与棒状体颈部蛋白一起聚集于虫体顶端并与宿主细胞表面相应受体结合，在虫体顶端与宿主细胞膜之间形成可移动的连接区域[19]，使得虫体顶端黏附于宿主细胞。虫体在肌-动球蛋白马达所产生的动力下进行滑行运动，并迅速挤过移动连接区域进入宿主细胞。随着虫体向前滑移，移动连接向虫体后方移动，当虫体完全进入后，移动连接会在虫体后方被菱形蛋白酶(rhomboid protein,ROM)作用水解而导致融合，其内陷部分在宿主细胞内形成纳虫空泡。一旦虫体被纳虫空泡完全包裹，致密颗粒就会受到调控开始分泌蛋白质并释放至纳虫空泡的腔内[20]，致密颗粒蛋白的分泌有利于虫体从宿主细胞获取营养。纳虫空泡膜起初的成分与宿主细胞膜成分几乎相同，伴随虫体在纳虫空泡内不断分泌相关蛋白与一些因子对其进行修饰，一些原有的宿主细胞膜成分被迅速排出。这一过程可使纳虫空泡避免宿主细胞溶酶体的裂解作用及酸化作用，从而起到隔离保护的作用。含有寄生虫的空泡缺乏正常内吞空泡的内容物，也不能在初级吞噬体中找到的典型决定因子，使得虫体躲避了宿主融合机制的识别，进而完成了一次完美的“隐秘”入侵[17]。虫体在其内以二分裂的方式进行繁殖，当繁殖到一定数量时，纳虫空泡膜破裂，虫体逸出，开始寻找新的合适的宿主细胞以预备下一轮入侵。

3 弓形虫入侵相关蛋白分子

弓形虫的入侵不是由一种蛋白质或者单一机制完成的，而是由许多蛋白质分子依靠多种调控机制协调合作实现的，其中表面抗原、微线体蛋白、棒状体蛋白、致密颗粒蛋白等在弓形虫主动入侵宿主细胞的过程中均发挥重要作用。

3.1 表面抗原

弓形虫表面抗原(surface antigens,SAGs)主要介导虫体对宿主细胞的初步识别与黏附。在已发现的SAGs家族中，与虫体入侵和毒力相关的蛋白质主要有SAG1、SAG2和SAG3[21]。其中，SAG1是弓形虫速殖子表达量最高的一种表面抗原，其含量高达弓形虫速殖子蛋白的3%～5%。SAG1以糖磷脂酰化形式锚定在宿主细胞膜表面，介导虫体与宿主细胞之间的黏附过程，帮助虫体进行入侵[22]。此外，SAG2和SAG3可以协助SAG1，使得虫体迅速进入宿主细胞。已有研究表明，特异性抗SAG2多克隆抗体可有效地抑制弓形虫速殖子的体外入侵效率[23]；而且，当对SAG3基因进行敲除后，发现虫体对宿主细胞的入侵效率也明显降低。由此证明，SAG2和SAG3对弓形虫的初始入侵过程具有重要意义。

3.2 微线体蛋白

微线体是弓形虫顶复合器的一个重要组成部分，其合成与分泌的微线体蛋白(microneme proteins,MICs)在虫体入侵宿主细胞的过程中发挥着重要的作用。当虫体与宿主细胞表面接触时，虫体顶端会分泌大量的微线体蛋白，对宿主细胞进行识别与黏附作用并形成移动连接结构。

微线体蛋白在分泌、运输与释放的过程中，常以复合体的形式发挥作用[24-25]。MIC1、MIC4和MIC6可形成复合体，MIC1和MIC4可结合宿主细胞并与黏附复合体的某些特性有关[26]。研究发现，MIC1是一种乳糖特异性凝集素，可能与靶细胞表面的含乳糖糖蛋白受体结合，由此促进虫体与宿主细胞黏附[27]。MIC3和MIC8也能形成一种黏附复合体，在虫体黏附和入侵过程中释放到虫体表面[26]。MIC3是复合物中的黏附成分，其具有一个凝集素结构域，可以识别宿主细胞表面的糖蛋白。第3种黏附复合体由MIC2和MIC2相关蛋白或M2AP组成。MIC2具有2种黏附因子(Ⅰ型结构域和类凝血酶样结构域)，负责宿主细胞膜的锚定与结合[28]。在虫体与宿主细胞相接触时，MIC2/M2AP复合物被释放到虫体表面并与靶细胞表面受体结合。

微线体蛋白复合体主要具备以下几种性质：首先，每个复合体中都含有一个跨膜蛋白，负责对宿主细胞膜的锚定；其次，每个复合体中都至少有一个蛋白质被去除前域，但这种前域处理的功能意义目前还尚未清楚；最后，每个复合体中都至少含有一个蛋白质可以与宿主细胞膜表面的相应受体进行结合[25]。基于以上性质，微线体蛋白在弓形虫穿透组织屏障、对宿主细胞进行黏附与入侵的过程中具有不可或缺的作用。

3.3 棒状体蛋白

在微线体蛋白分泌过程中，棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)也紧随其后开始进行分泌。棒状体蛋白主要分为2种，即棒状体颈部蛋白(rhoptry neck proteins,RONs)和棒状体蛋白。前者与移动连接的形成有关，而后者则参与纳虫空泡的形成与修饰[26]。

当弓形虫与宿主细胞膜接触时，虫体顶端分泌大量RONs(如RON2、RON4、RON5和RON8)，微线体相关蛋白在宿主细胞膜和弓形虫质膜间形成一个紧密连接的结构，称为移动连接(moving junction,MJ)。移动连接的形成有利于虫体更加稳固的与宿主细胞膜结合。在弓形虫入侵宿主细胞的过程中，ROPs(如ROP2)的分泌有利于纳虫空泡(parasitophorous vacuole,PV)的形成，并帮助虫体从宿主细胞中获取营养。已有证据表明，ROP2可介导膜上纳虫空泡的细胞器滞留，其N末端的一个区域可作为线粒体输入序列的一个模拟片段，可将宿主细胞的线粒体聚集在纳虫空泡膜上[29]。ROP2与宿主细胞线粒体的紧密结合有利于虫体摄取生长所需的营养物质，对纳虫空泡内虫体的生存与增殖具有十分重要的作用。ROP18是弓形虫重要的毒力因子之一，具有激酶活性，其在弓形虫增殖方面具有控制作用[29]。同时，ROP18还可促进宿主免疫相关GTP酶发生磷酸化，阻止宿主体内巨噬细胞对虫体的吞噬和清除，从而保护虫体免受宿主免疫系统的攻击[30]。ROP16也是弓形虫重要的毒力因子之一，经虫体分泌释放后进入宿主细胞，通过介导宿主细胞的信号转导而影响宿主细胞相关细胞因子的释放，从而对纳虫空泡起到保护作用[29]。

3.4 致密颗粒蛋白

致密颗粒是一种分泌性细胞器，当虫体完全进入宿主细胞后，致密颗粒分泌的相关蛋白质被释放至纳虫空泡内，完成纳虫空泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)修饰作用的最后一步[31]。已有的动力学分析显示，在虫体侵袭宿主细胞的前30 min内，致密颗粒分泌物含量显著升高[32]。致密颗粒主要分布在PV和PVM中，在宿主细胞的细胞质和细胞核成分中也有分布[26]。致密颗粒蛋白(dense granule antigens,GRAs)在维持纳虫空泡的结构与完整性具有重要功能，如GRA3、GRA5、GRA7、GRA8和GRA14等均参与了对PV的修饰作用。同时，GRAs还通过调节宿主细胞的功能来确保虫体在宿主细胞内的存活与复制。已有研究发现，GRAs与一种叫做HOST(host organelle sequestering tubular)的结构有关，该结构通过调节宿主细胞向纳虫空泡传递内体和溶酶体的过程，影响虫体从宿主细胞获取所需营养，从而降低虫体的存活率[26]。此外，研究还发现GRAs与IVN(intravacuolar network)的形成有关。IVN是一种连接PV内虫体与PVM的桥梁结构，由此可见，GRAs极有可能参与了弓形虫与宿主细胞之间的营养交换过程[26]。此外，致密颗粒蛋白在运输过程中也会形成复合物，如GRA6、GRA7与GRA9[32]。然而，目前对于GRAs的转运机制尚不完全清楚，仍需进一步研究。

4 展望

弓形虫入侵是一个独特且复杂的过程，研究其入侵过程的分子机制对于弓形虫病的诊治、预防以及相关疫苗的研发具有重要意义。目前，国内外已基本明确了SAGs、MICs和ROPs等蛋白分子在弓形虫黏附与入侵过程中的作用机制；然而还有许多问题尚不明确，如纳虫空泡是如何向外排除成分的、增强钙释放的自然触发因素是什么、弓形虫在感染单核巨噬细胞后是如何改变其信号通路的、致密颗粒的发生机制又是如何被调控的等诸多问题都亟待解决。这些问题的解决将使人们对弓形虫入侵宿主的复杂机制有更深层次的认知，为将来弓形虫病的有效预防与治疗奠定坚实的理论基础，从而保障和改善全球动物和人类的健康。