轮状病毒感染对宿主天然免疫影响的研究进展

王晶莹，王春凤，叶丽萍，杨桂连，曹 欣

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118)

轮状病毒(Rotavirus，RV)属呼肠孤病毒科，有A至H共8种，其中感染A种的最多，病毒颗粒无囊膜，由包裹着11个基因组双链RNA片段的3层蛋白组成。感染RV可立即激活宿主天然免疫，主要表现为干扰素(interferon,IFN)的分泌，包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型IFN。IFN的分泌导致感染和未感染细胞中数百种具有抗病毒活性的干扰素刺激基因(IFN-stimulated gene,ISG)的表达。此过程需要模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)的识别，为引起不同类型IFN和ISG的分泌，机体通过不同类型的PRRs来识别RNA病毒，主要有Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)、视黄醇诱导基因Ⅰ样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)、核苷酸结合寡聚化结构样受体(NOD-like receptors，NLR)。这些PRRs识别不同的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，细胞分泌的IFN和其受体结合，通过自分泌和旁分泌，激活JAK-STAT通路，诱导大量ISGs的表达，ISGs可限制病毒生命周期的各个阶段(进入、脱壳、转录、翻译、组装和释放),从而建立抗病毒状态。

虽然在病毒基因组合成过程中通常会激活IFN通路，但RV采取多种措施保护其感染期间不受天然免疫攻击。病毒在与宿主长期的斗争中，必须要通过各种机制逃避免疫系统的识别和攻击，比如抑制IFN产生、破坏IFN的信号传导、逃避宿主的识别、调节细胞凋亡及细胞自噬等。RV也可通过多种途径来逃避天然免疫，其非结构蛋白2(non-structural protein 2，NSP2)可介导干扰素调节因子(IFN regulatory factors,IRF)、RIG-Ⅰ、β转导重复相容蛋白(β-transducin repeat-containing protein,β-TrCP)、肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)和转录激活子(signal transducers and activators of transcription,STATs)等宿主免疫应答通路中重要分子的降解；VP3可介导线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)降解、阻止2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(OAS) / RNase L通路的激活以及作为盖帽酶保护病毒转录过程中免受宿主识别；RV为了避免在复制过程中基因组被细胞识别，编码了一些蛋白与RNA结合，如非结构蛋白2(non-structural protein 2，NSP2)和结构蛋白2(viral protein 2，VP2)。在体外，RV通过内体-溶酶体途径降解来消耗多种类型的干扰素受体(interferon receptor,IFNR)，可抑制IFN介导的STAT1活化和转录[1]。

1 NSP1拮抗天然免疫

NSP1蛋白由RV的第5段基因编码，对于病毒复制不是必须的，NSP1基因被截短的毒株与野生型相比，在细胞中的复制滴度相似，但噬菌斑较小，表明NSP1对于RV在细胞间的传播至关重要。NSP1是RV蛋白质组中保守程度最低的成员，不同来源毒株的NSP1差异较大。NSP1蛋白的C末端序列可变性最高，它通过C末端与不同宿主蛋白相互作用，以蛋白酶体依赖的方式诱导IRF3降解；N端有一个RING结构域，使NSP1发挥E3泛素连接酶功能，降解IRFs和β-TrCP蛋白，阻断IFN信号通路和NF-κB通路。

1.1 NSP1多种途径拮抗干扰素应答

干扰素调节因子(IRF)家族以其在干扰素诱导中的作用而得名，广泛影响细胞免疫反应。IRFs(IRF1-IRF9)N端含有保守的DBD结构域，可识别IFN基因启动子区域和ISGs中的干扰素刺激反应元件(IFN-stimulated response elements,ISREs)；IRF3-IRF9中C端IRF结合结构域IAD1和IRF1/IRF2中的IAD2介导IRF的同源和异源二聚化以及与其他转录因子(包括STAT家族成员)的结合，来自PRRs的刺激信号诱导IAD磷酸化或二聚化，导致IRF核转位和DBD与ISREs结合，上调ISGs的表达，发挥抗病毒作用。

研究显示，野生型NSP1通过蛋白酶体途径可使IRF3快速降解——IRF3二聚化和核转位严重降低，缺乏IFN启动子活性，而C端截短的NSP1不能诱导IRF3蛋白的降解，尽管N端RING结构域对NSP1蛋白与IRF3的结合也是必须的[2]。之前的研究发现，破坏NSP1的RING结构域后，NSP1不能与IRF3相互作用使其降解，证明NSP1可能作为E3泛素连接酶发挥功能。IRF3是第一个被发现的被NSP1降解的宿主蛋白，IRF5、IRF7和IRF9也是NSP1介导降解的靶点，因为它们在结构域上与IRF3相似[3]。通过将IRF3截短，证明IAD为SA11-4F NSP1降解所需的最小结构域，且NSP1只识别含有IAD1的IRF[3]。IRF4、IRF6和IRF8也具有C末端IAD1结构域，NSP1是否能介导它们的降解还需进一步研究。

1.2 NSP1拮抗核转录因子-κB信号通路

与IRFs一样，在天然免疫反应中，核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)家族的转录因子p50、p52、p65、RelB和c-Rel发挥关键作用[4]。IκB是NF-κB的抑制体，当细胞处于静息状态时，与NF-κB形成无活性的复合物。来自PRRs和其他分子的信号激活IκB激酶复合物，IκB激酶复合物将IκB磷酸化，该磷酸二聚体被β-TrCP识别，为E3泛素连接酶的SCF家族提供靶向性，SCFβ-TrCP诱导磷酸化的IκB翻转，释放NF-κB移位到细胞核，并在IFN和ISG启动子区域与κB基因结合。

与大多数RVA毒株的NSP1蛋白不同，OSU NSP1诱导β-TrCP 的蛋白酶体依赖性降解[5]。β-TrCP是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信号通路的中心靶标。因此，p65不会移位到细胞核，p50也不会与DNA结合，达到抑制NF-κB通路的作用。据报道，RV NSP1需要宿主Cullin-E3连接酶复合物来降解β-TrCP。对HT-29细胞宿主基因表达的微阵列分析表明，感染SA11-4F、Wa或牛A5-13 RVA上调肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-inducible protein 3,TNFAIP3)基因的转录[6]。TNFAIP3(或A20)是一种锌指蛋白，可在包括PRRs在内的众多刺激下抑制NF-κB的激活[7]。NSP1残基101和C末端之间的NSP1区域(不包括N端RING域)介导与TRAF2的相互作用介导蛋白酶体依赖的TNF受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)的降解，抑制NF-κB非经典途径的活化[8]。其他一些毒株的NSP1也可介导TRAF2的降解，如SA11和OSU毒株。

1.3 NSP1介导视黄醇诱导基因Ⅰ样受体及其接头蛋白的降解

RIG-Ⅰ、黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene-5,MDA5)和LGP2(laboratory of genetics and physiology2,LGP2)通过DExD/H-box解旋酶和C末端结构域识别细胞质中dsRNA。当与dsRNA结合时，RIG-Ⅰ和MDA5中的N末端caspase招募结构域(CARD)介导与MAVS的结合和寡聚化，最终导致IRF和NF-κB的激活。与大多数RNA病毒在细胞内与RIG-Ⅰ或MDA5相互作用不同，轮状病毒可被RIG-Ⅰ和MDA5单独或联合识别，沉默RIG-Ⅰ或MDA5或它们的共同接头蛋白MAVS可显著降低感染的肠上皮细胞中IFN-β的产生，增加轮状病毒滴度。SA11 NSP1通过其C末端与MAVS的CARD和TM结构域相结合，与全长的NSP1相比，A5-16 NSP1 不能阻断MAVS聚集体的形成和IFN-β的诱导，从而证实了NSP1 C末端在拮抗MAVS中的作用。

1.4 NSP1与细胞凋亡：NSP1介导的磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)通路的激活和p53的降解

细胞被病毒感染后，细胞启动早期凋亡机制将病毒限制在少数细胞内，抑制病毒大量复制并感染其他细胞。已经发现很多病毒通过P13K/Akt通路来防止细胞过早凋亡。RVA A5-13可诱导蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及其底物之一糖原合酶激酶3β(GSK3β)快速而持久的磷酸化，最终导致细胞凋亡的延迟[9]。但RVA A5-16在感染细胞中没有此作用，A5-13 NSP1与PI3K的P85亚基相互作用，表明NSP1的C-末端区域可能是这种联系所必需的。P13K由2个亚基组成，即p110和p85，其中2个异构体(p85α和p85β)通常与病毒蛋白相互作用[7,10]。NSP1的N端和C端片段均可与P85α相互作用，但P85β优先与全长NSP1结合。由于PI3K/Akt通路也可激活ISGs的转录，NSP1可能有助于中和这一反应，发挥拮抗天然免疫的效应[10]。PI3K/Akt活性的靶标之一是p53，它是一种应激反应转录因子，在细胞凋亡、细胞周期调节和其他过程中发挥重要作用。Bhowmick R等[11]研究表明，SA11-4F的NSP1介导了p53的转录后耗尽，且全长的NSP1诱导蛋白酶体途径的p53降解，而C末端截短的NSP1没有这种作用。NSP1通过C末端与p53的DBD结构域相互作用。

1.5 NSP1与STAT家族

大多数ISG的表达依赖于STAT1，STAT1招募干扰素受体，随后JAK磷酸化络氨酸残基(Y701)，STAT1的磷酸化导致STAT1、STAT2和IRF9的复合物在Y701位点上形成，被称为干扰素刺激因子3(interferon-stimulated factor 3，ISGF3)，诱导包括ISRE和IFN-γ激活位点(GAS)的抗病毒ISGs的转录。Ⅲ型干扰素通过pY701-STAT1/ISGF3发挥作用。因此IFN下游的抗病毒反应依赖于STAT-Y701的磷酸化。研究发现，RV不仅可以抑制感染细胞中STAT-Y701的磷酸化，还可介导未感染细胞中的这种抑制作用。进一步研究表明，非结构蛋白NSP1可抑制STAT-Y701的磷酸化，且不是通过RING结构域[12]。另外有研究认为，NSP1的第47位氨基酸后的残基可能对STAT有抑制作用。

2 除NSP1外其他蛋白拮抗天然免疫的机制

2.1 VP3拮抗天然免疫

完整的MAVS信号在诱导IFN对PAMPs的应答中起着关键作用，并对后续适应性免疫应答也至关重要[13]。研究表明，VP3 通过N端结构域可与MAVS直接作用，导致MAVS的降解，这种影响通过一种新的磷酸化基序SPLTSS完成，且似乎受宿主范围限制[14]。C端的PDE结构域可阻止RNaseL的激活[15]。总的来说，VP3是两种蛋白的综合体，当病毒转录本从RV DLPs中出现时，VP3会对其进行封盖，增加其转译活性，也可阻止宿主RNA传感器的激活，它通过裂解信号分子2-5A直接拮抗dsRNA应答的OAS/RNase L通路[16]。在感染期间，VP3也可能在细胞的两个不同区域发挥作用，在病毒颗粒内作为盖帽酶，也可能在细胞质内作为直接的天然免疫拮抗剂。

2.2 NSP2、VP2、NSP3帮助病毒RNA逃避天然免疫

NSP2是一种非特异性的ssRNA结合蛋白。VP2有较强的RNA结合活性[17]，可能因为NSP2和VP3与RNA相互作用形成复合物，避免了PRRs对RNA的识别。再加上VP3对RNA的封盖作用，虽然可能并不完全，但一定程度上发挥了逃避天然免疫的作用。非结构蛋白NSP3蛋白C末端取代多聚腺苷酸结合蛋白(poly(A)-binding protein,PABP)与真核细胞翻译启始因子elF4G相互作用，抑制细胞mRNA的翻译，NSP3也可与病毒转录本3′端UGACC序列结合，刺激病毒mRNA翻译[18]。

3 轮状病毒激活天然免疫机制

3.1 NSP4激活天然免疫

NSP4是一种跨膜糖蛋白，参与病毒的复制，在体内与一系列细胞相互作用，启动一系列信号通路，并有助于轮状病毒感染[19]。轮状病毒新合成的双层病毒粒子DLPs通过内质网出芽获得最外层的VP4和VP7，最后通过裂解或胞吐的方式将子代病毒粒子排出细胞[20]，此过程需要NSP4蛋白参与[21]。

早期研究发现，从轮状病毒感染的细胞培养液中提取的NSP4蛋白可与不同细胞结合，包括免疫细胞。Kavanagh O V等[22]研究发现，NSP4在小鼠体内与模型抗原共同免疫时具有佐剂样效应，进一步说明NSP4可能在调节机体免疫方面发挥作用。随着研究的不断深入，学者们发现，NSP4可诱导巨噬细胞内的信号传导，刺激炎性因子的产生，此过程是通过TLR2受体以及MyD88接头蛋白介导的，NSP4诱导IKKα和IKKβ亚单位，p38和JNK磷酸化，从而引起NF-κB通路的激活[23]。

3.2 其他病毒结构及产物对天然免疫的激活

轮状病毒入侵后激活细胞内免疫反应通常涉及的两种PRRs为RIG-Ⅰ和MDA5，然后触发MAVS的激活。激活这些受体的可能是RV的5′磷酸基团，不完全的甲基化5′Cap结构和局部的dsRNA[24]。除了RIG-Ⅰ和MDA5外，RV还可激活LGP2(RLR家族的第3个成员)以及dsRNA依赖的蛋白激酶PKR，导致细胞分泌IFN[24]。

NOD样受体(NOD-like receptors,NLR)蛋白炎症体亚家族是NLRs家族成员中最丰富也是最复杂的亚家族，被激活后与凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和半胱天冬氨酸蛋白酶-1(cysteiny laspartate-specific protease-1,caspase-1)形成炎症小体复合物，并介导促炎因子分泌和细胞焦亡关键蛋白Gasdermin-D(GSDMD)诱导的细胞焦亡[25]。此过程不仅有助于宿主防御细菌及其他微生物感染，还能调节免疫系统的动态平衡。研究发现，Nlrp9b在肠上皮细胞中表达，当RV短dsRNA延伸时，被RNA解旋酶Dhx9识别，与Nlrp9b形成复合物而激活Nlrp9b，限制RV的复制[26]。

4 结语

轮状病毒必须克服宿主的抗病毒反应才能成功复制，在复制的所有阶段都与宿主相互作用，随着宿主进化出防御病原体的机制，病毒反过来又进化出逃避宿主免疫反应的策略。NSP1在拮抗先天免疫中扮演着重要作用，从逃避宿主PRRs的识别，到从各个方面抑制INF通路和NF-κB通路发挥抗病毒作用，还可抑制细胞过早凋亡，有助于轮状病毒的复制和感染。关于NSP1还有许多问题，NSP1具有如此多的功能，但多种不同的宿主蛋白是如何结合到NSP1 C端同一位点的？仍有待深入探究。其次，VP3在逃避天然免疫的识别中也有着突出贡献，N端和C端分别发挥作用，一方面防止病毒RNA被宿主识别，另一方面抑制IFN通路的激活。另外，还有其他蛋白在病毒复制中扮演着不同的角色。了解轮状病毒与宿主先天免疫的相互作用，才能更好地对抗它们，研制新型抗病毒药物，减少轮状病毒给人类带来的危害。