聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶的研究进展

赵彧瑾，陈仔君，赵晶晶，苏婷婷*，王战勇

(1.辽宁石油化工大学 石油化工学院，辽宁 抚顺 113001；2.沈阳农业大学 生物科学与技术学院，辽宁 沈阳 110866)

现代社会的日益商品化以及塑料与各行业的紧密关联，使得全球对塑料的依赖程度逐年提高。据研究统计，每年全球大约生产1亿 t塑料制品，并呈逐年上升趋势[1]。尤其在2020年于抗击新冠肺炎疫情中，主要由塑料材料制成的手套、面罩、防护服等对病毒传播的控制更是发挥了重要作用[2]。聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate, PET)由于具有优越的力学性能和良好的实用性，目前已成为广泛使用的塑料材料之一[3]，在2020年全球PET产能就突破了1亿t[4]。目前PET已应用于工农业各个领域，如饮料或矿泉水瓶、薄膜以及涤纶服装等[5]，由此也产生了大量的PET废弃物。虽然很多国家已经开始回收利用废弃的PET，但数量很少，大部分废弃PET未能得到有效回收，这些物质经过大气紫外辐射、自由基氧化以及海水水解等作用发生脆化，产生肉眼不可见的微塑料，这些微塑料可被水生生物吸收，人类作为食物链的顶端，摄入这些水生生物后，可能会富集大量的微塑料于体内，对人体健康造成难以预计的危害[6]。众所周知，微生物在污染物的清除和生态系统的物质循环中发挥着重要作用。自20世纪90年代以来，微生物酶在降解高分子材料方面的应用已开始引起人们的关注。酶的催化降解为解决塑料造成的环境问题提供了一个独特的方案。自从2005年Müller等[7]从嗜高温放线菌的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)中发现了第一个PET降解酶，到现在已有多个研究团队对多种微生物来源的PET降解酶进行了一系列的研究。在相关研究领域尤其是针对PET降解酶的研究取得了一定进展。本文就PET降解酶及其降解机制进行了综述，并进一步对其在PET废弃物处理的应用及发展前景方面进行了探讨。

1 脂肪酶

脂肪酶又称甘油酯水解酶，因其催化水解长链(>C10)的甘油三酯而广为人知，属于羧基酯水解酶类，其特点是界面活化现象。脂肪酶可通过增强PET织物的润湿性、染色性和吸收性，在一定程度上对其进行降解[7]。2005年Müller等[7]首次报道，源于褐色嗜热裂孢菌芳香族聚酯酶能够降解聚己二酸-对苯二甲酸丁二酯，在后来的研究中发现其也可以降解PET。德国研究者从褐色嗜热裂孢菌的培养上清液中纯化出一种可水解聚丁烯对苯二甲酸-共己二酸酯的降解酶(BTA-1)[8]，在55 ℃条件下该降解酶能在3周内将商业PET饮料瓶和PET颗粒水解40%～50%。此后Lykidis等[9]对褐色嗜热裂孢菌＿ YX的全基因组进行了测序，确定了两个三酰基甘油脂肪酶基因的存在，其中Tfu0883与BTA-1完全匹配。Eberl等[10]通过阳离子染色和X射线光电子能谱等技术确定了从绵毛嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)中分离得到的脂肪酶不仅能水解PET组成的单体寡聚物——双(苯甲氧基乙基)对苯二甲酸乙二醇酯(bis-(benzoyloxyethyl)terephthalate, 3PET)，还能水解多聚物，如PET织物和薄膜。但是脂肪酶在活性位点上具有“盖子”结构，这种结构的存在抑制了大分子进入活性位点的可能性，使得聚合物与催化中心结合困难，导致脂肪酶对PET的水解活性偏低。该研究还表明非离子洗涤剂Triton X-100能够激活脂肪酶的“盖子”结构，使其对3PET的降解能力明显增强。

2 酯 酶

酯酶通常裂解水溶性短链甘油酯(

2010年Billig等[11]将嗜热放线菌褐色嗜热裂孢菌KW3b在含有PET纤维的培养基中培养，产生了分子量为50 kDa的酯酶(TfCa)。TfCa能够水解回收的PET薄膜，且TfCa对短链和中等链长(C2～C8)的对硝基苯基酯均具有水解活性，但对长链酰基酯没有裂解作用(C16)。相比之下，此前报道的褐色嗜热裂孢菌DSM 43793角质酶(TfH)对C2～C6酰基链和C8、C10、C12、C18酰基链酯均具有酶促活性，因此，该角质酶同时具有酯酶和脂肪酶的特性[8]。在之后的研究中Ribitsch等[16]发现来自裂孢菌属(Thermobifida)Thh_Est的酯酶(Thh_Est)对PET表现出有效的表面水解，且其作用与来自裂孢菌属的角质酶相似。

3 PETase与MHETase

2016年Yoshida等[17]从PET瓶回收厂收集了包括沉淀物、土壤、废水和活性污泥等250个样本，从中筛选出一种可利用低结晶度(1.9%)PET膜作为主要碳源的菌株Ideonellasakaiensis201-F6。将该细菌产生的PETase在30 ℃下与PET薄膜(1.9%)孵育6周后，将PET薄膜降解为低分子量的低聚物或单体，如对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate, BHET)和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate, MHET)。Yoshida等还比较了PETase和部分角质酶的催化效率，发现PETase的活性优于其他角质酶。研究中还发现了一种MHET水解酶(MHETase)，能与PETase配合，将PET的主要中间产物MHET特异性水解成对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)和乙二醇(ethylene glycol, EG)，对PET的完全降解起着重要作用，具体水解过程如图1所示[17]。虽然PETase已经引起了相当大的关注，但相比于其他的PET降解酶[18-19]，PETase的降解能力和稳定性较差，37 ℃下其大部分降解活性在12 h内基本消失[19-20]。Cui等[19]发现PETase的降解能力仅发生在微摩尔水平，并将PETase突变为更嗜热的类型DuraPETase，虽然结果表明该突变酶在60 ℃高温下孵育3 d仍能保持活性，且在温和温度下对半结晶PET薄膜的降解率达到23%，但综合来看其热稳定性和降解率仍然偏低。

图1 源于Ideonella sakaiensis 的PETase降解PET的过程[17]

4 角质酶

角质酶是一种α/β-水解酶，属于胞外丝氨酸酯酶，存在于某些细菌和真菌中。最初被发现于某些植物病原菌和昆虫病原菌中，其中以源于腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的角质酶被研究的最为广泛[21-22]。Carvalho等[23]对角质酶在水解和合成反应中的生物催化潜力进行了总结，并通过对聚酯降解的研究，发现角质酶在聚酯的降解中起着决定性作用[24-25]。2009年，Ronkvist等[26]发现一种嗜热真菌特异腐质霉(Humilicainsolens)的角质酶(HiC)能够在70 ℃下完全降解非晶态PET，而且HiC还具有很好的热稳定性。同时Ronkvist等也证明了门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)的角质酶(PmC)和腐皮镰刀菌的角质酶(FsC)均能够将PET降解成TPA和EG。2012年，Sulaiman等[27]利用宏基因组方法从植物堆肥中克隆了一种能够降解PET的角质酶(LCC)，LCC被认为可能是来自堆肥中的放线菌。Danso等[28]开发了一种搜索算法，从各种数据库中识别出504个可能的PET降解酶候选基因。其中包含了从IMG数据库中获得的108个海洋宏基因组和25个陆地宏基因组中超过16 GB的序列信息，检测到了349个可能的PET降解酶，并表征了两种具有较高应用潜力的新型耐高温酶。基于氨基酸的相似性对这504种候选酶的聚类表明，这些PET降解酶主要来自放线菌门、变形菌门(β、δ和γ)和拟杆菌门。值得注意的是，在海洋环境中，隶属于拟杆菌门的细菌似乎是PET降解酶基因的主要宿主。在陆地环境中，PET降解酶主要来自放线菌。此外，基于数据库和宏基因组的分析还发现，PET降解酶是一类相对罕见的酶，虽然数据库和宏基因组涵盖了陆地和海洋环境，但是这些环境的某些特殊地区仍有待充分分析，特别是极端环境，如火山、两极地区、深海和湖泊、酸性和碱性环境以及高盐度地区。此外，还有研究证明了无脊椎动物体内的微生物群也有可能是塑料降解酶的重要来源[29-30]。

总之，降解PET的角质酶一般都具有良好的降解活性和热稳定性。其中来自嗜热放线菌和绿色糖单孢菌、植物堆肥(可能是放线菌的混合基因)和嗜热真菌特异腐质霉的角质酶被认为是嗜热PET降解酶，到目前为止，从特异腐质霉中提取的商业化角质酶对非晶态PET薄膜的水解效果最为显著，但其具体的水解途径和其他因素尚未有报道。此外，与脂肪酶相比，角质酶具有开放的、浅的活性位点，没有“盖子”结构，可以容纳大量的聚酯链，并使其与活性丝氨酸在催化三联体(Ser-His-Asp)处接触。Joo等[31]将催化三联体中的Ser、His和Asp突变为Ala，发现角质酶对PET薄膜和BHET的降解失去了催化活性，说明这3个残基是酶催化反应的关键组成。

4.1 角质酶来源

角质酶最早发现于植物和昆虫病原真菌。在研究过程中逐渐发现角质酶不仅能够降解植物角质还具备降解脂肪族聚酯(尤其是PET)的能力。2005年，Silva等[32]利用腐皮镰刀菌角质酶对几种合成纤维的表面进行改性，发现该角质酶可将PET水解为TPA和EG，而且反应最佳温度低于50 ℃。Yang等[33]从太瑞斯梭孢壳霉中分离得到一种低分子角质酶(TtcutA)，研究发现TtcutA能够有效降解各种酯类聚合物，包括PET、聚己内脂和聚丁二酸丁二酯。重要的是太瑞斯梭孢壳霉能够在50 ℃或以上的条件生长良好。关于PET的酶促表面修饰的研究大约开始于40年前，并在随后的许多研究中表明真菌角质酶适合用于PET织物/纤维的改性[18,25]。这些真菌角质酶属于表面修饰酶，并没有直接降解PET的特性，而是能够将PET薄膜或纤维表面酯键部分进行酶解导致表面性质发生改变，使其亲水性能提高。唯一例外的是一种商品化真菌角质酶HiC，其最佳催化温度为75～80 ℃，可在70 ℃下高效水解非晶态PET[26]。相比之下，其他真菌角质酶的最佳反应温度一般为50 ℃左右。因此，其对非晶态PET的降解率非常低。

在已报道的PET降解酶中大多数角质酶均来自于放线菌。Thumarat等[34]报道了源自白色高温双歧菌(Thermobifidaalba)AHK119的两种角质酶基因(est1和est119)的遗传图谱，两种角质酶具有95 %的同源性和98%的相似性。目前报道的所有裂孢菌属微生物均显示存在角质酶基因且基因序列相似度很高，因此，具有降解PET能力的角质酶可能均来自裂孢菌属微生物[8]。Kawai等[35]从绿色糖单孢菌AHK190中克隆出一种角质酶(Cut190)基因，并实现了其在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中的表达，且Ca2+能够使该酶在75 ℃仍然具有较高的热稳定性。除此之外，之前提到的源于褐色嗜热裂孢菌[7]的角质酶和堆肥宏基因组的LCC[27]也是为数不多的嗜热角质酶，与其他角质酶相比，其具有较高的水解活性和热稳定性，这可能是因为它们均来自于高温环境。

角质酶尤其是放线菌角质酶能够降解PET薄膜，且可以有效地将低结晶度的薄膜完全降解成对人体无害的CO2和H2O等。PET表面亲水性越高，降解PET所需温度就越低，因此对PET表面进行改性可使PET更容易被降解。而PET降解酶的作用也可以有助于PET的表面亲水，因此可以利用这一点对PET表面进行改性，筛选鉴定或设计更有效的PET降解酶也已成为当前的PET酶促降解研究的工作重点。

4.2 角质酶PET降解机制

基于Joo等[31]对PET降解酶结构观察和生化研究，提出了以下PET降解机制(图2)。以PET降解酶的代表性角质酶TfCut2[36]为例，PET的初始降解是由TfCut2的残基Y60和M131的主链氮原子与底物PET的羰基氧原子形成氧阴离子空穴，I178和Y60为底物PET提供疏水作用力，使易裂解的酯键靠近催化三联体中的活性丝氨酸[1]被催化断裂，进而形成两条末端不同的PET链(TPA末端链和HE末端链)。随后TPA末端链和HE末端链被降解成多种PET二聚体或单体，如2-HE(MHET)2、(MHET)2、BHET、MHET、TPA等，最终被消化为MHET、TPA和EG形式的单体。该过程说明PET降解过程中TPA的积累主要来源于TPA末端链的末端消化步骤。

图2 角质酶PET降解机制[31]

4.3 角质酶的分子改造

目前，许多提高PET降解性能的研究实验正在接近实际可应用的水平，现有的某些PET降解酶能够有效地降解非晶态PET。最近，法国科学家Tournier等[37]通过分子改造后的手段将先前报道的LCC进行优化以提高其酶活性和热稳定性。经10 h以上的作用，PET至少有90%可被改造后的LCC解聚成单体(TPA)，这一改造酶的性能优于之前报道的所有PET水解酶，包括Ideonellasakaiensis201-F6中的PETase以及最近引起关注的改造酶[31,38-40]。此外，该酶催化所产生的PET单体经过纯化后再次合成PET，最终制成塑料瓶，从而实现了循环经济。

到目前为止，已发现的PET降解酶分别为脂肪酶、酯酶和角质酶等，其中角质酶是研究最广泛也是最有效的一类PET降解酶，角质酶不仅可以使PET表面改性，还能够在适宜温度下显著降解PET。同时角质酶有优于其他酶类的晶体结构，因此降解PET的角质酶具有巨大的发展潜力。

5 展 望

目前，对PET降解酶的研究已有一定的进展，根据已报道的降解酶的晶体结构及其降解机理，有望筛选或设计出更有效的PET降解酶。尽管高结晶度和PET水瓶材料的新型聚酯降解酶的开发仍然具有挑战性，但非晶态PET薄膜(主要是包装材料)的降解已经能够很好地实现。因此，从环境中筛选新的PET降解酶仍是十分必要的，事实上目前这一领域的研究还不够充分。未来PET生物降解研究的工作重点应该集中在两个主要方面：①改善降解酶的热稳定性：为了解决这一问题，既需要筛选新的高效降解酶，也需要对已经存在的或新鉴定的降解酶进行分子改造。此外，还必须研究降解产物是否会产生抑制。②PET材料的改性：在不改变材料基本性能的前提下，通过化学或物理方法控制分子量、降低结晶度或者增加表面积，使得PET更易被降解酶作用。这些工作需要生物化学和高分子化学等多个领域的研究人员共同完成，如果能解决上述这些挑战性的工作，使得无论是非晶态还是高结晶度PET都可以进行酶促降解并实现产物回收利用，将有助于从根本上解决白色污染带来的环境污染问题，实现循环经济发展。