重离子诱变微生物育种的研究进展

汶 瑛,于 雪, 吴玉洁, 张 威, 陈 拓, 刘光琇*

(1.中国科学院西北生态环境资源研究院 沙漠与沙漠化重点实验室,甘肃 兰州 730000;2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国科学院西北生态环境资源研究院 甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室，甘肃 兰州 730000)

重离子束即原子序数大于2且原子核外围电子剥离或部分剥离形成具有能量的带电离子束，一般都指正离子[1]。20世纪以来，重离子诱变因具有突变率高、突变谱广[2]、无毒无害等优点，已经广泛应用于生物育种、疾病诊断和治疗[3-4]。重离子束和X射线、γ射线等辐射诱变手段均属于物理诱变。与传统诱变方式不同，重离子具有较高的传能线密度(Linear energy transfer, LET)，离子穿透径迹上有较大的能量沉积[5]，从而具有更高的相对生物学效应(relative biological effectiveness, RBE)。重离子辐照对细胞的直接刻蚀作用会造成碱基替换[6]、DNA链断裂[7-9]，引发染色体畸变，如染色体缺失或重排[10]，包括双着丝粒、无着丝粒、易位和缺失突变[11-12]，阻碍DNA复制，从而改变生物细胞的遗传特性。近年来，科研人员发现LET值可能是影响重离子诱变效果的关键因素[11,13-16]。随着LET值的增加，DNA单链断裂(single-strand breaks, SSBs)[17]、双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)会增多，DNA损伤的复杂性增加[18]。低线性能量转移辐射造成的DSBs可以被快速修复，但由高LET辐射诱导细胞出现的DNA团簇损伤(Clustered DNA damage)[19]比单个DNA损伤修复更困难或无法修复。因此，高LET的重离子束诱导细胞产生修复困难的DNA损伤使其在生物育种上具有明显的优势。研究表明，相比于X射线、γ射线和电子、重离子在植物中诱发突变的效率高10倍以上[20]。随着工业生物技术的发展，微生物产品已经越来越多的应用到抗生素、酶、农药、染料等领域。目前，12C6+离子束主要用于微生物育种和植物育种，能量范围约为80～1 000 MeV/u[21]。重离子束辐照技术已经成功应用于工业微生物的高产菌株选育，如芽胞杆菌[22]、黑曲霉[23]、阿维链霉菌[24]等，并取得了较好的效果。本文将简要总结近年来重离子辐照在微生物育种中的研究进展，以期对应用重离子改造微生物的遗传代谢提供参考。

1 重离子辐照在高产微生物育种中的应用

由于重离子对微生物遗传效应的显著影响，目前通过辐照诱变获得高产、稳定的菌种已应用于食品、药品、农业等多个领域。真菌已广泛应用于食品工业及抗生素生产，重离子诱变真菌突变株已有诸多应用。例如，在80 MeV/mu的12C6+离子辐照下获得的高产黑曲霉菌株柠檬酸产量明显高于原始菌株[23,25]。Li等[26]在80 MeV/u12C6+辐照条件下筛选出一株能将洛伐他汀(Lovastatin)产量提升4倍的土霉属菌株Z15-7。Dong等[27]用重离子束对原始菌株烟曲霉MS13.1进行诱变后，突变菌株的β-葡萄糖苷酶活性增加15.1%。

在细菌类群中，重离子诱变在获得高产抗生素菌株上也已取得积极进展。例如，阿维菌素被广泛用于杀菌、杀虫、除螨，使用12C6+离子辐照阿维链霉菌，有利于提高阿维菌素的产量[24]。Song等[28]使用12C6+重离子辐照和亚硝酸钠的联合处理，筛选得到的突变株阿维菌素产量提高了23.8%。此外，重离子辐照技术已成功应用于诱导金霉素[29]、角黄素[30]、丁酸[31]高产菌株。

重金属污染严重影响环境和人体健康，拥有特定重金属耐受性的菌株可以在不利条件下生长并储存重金属以减少其对环境和人体的危害。已有研究表明，微生物可用来解决重金属对土壤的污染问题[32]。Kumar等[33]发现黄曲霉可吸收污水中的六价铬。Li等[32]使用碳离子束辐照提高了ArthrobacterC2的抗Cd2+特性，与原始菌株相比，由12C6+束照射的Cd2+抗性突变菌株C2可以在Cd培养基中生长，范围为20～100 mg/L。因此使用重离子诱变技术提高微生物重金属耐受性，将其应用于治理镉污染的废水和土壤是可行的。此外，12C6+重离子诱变也可提升嗜酸乳杆菌的乳酸积累[34]。

重离子辐照诱导藻类突变株的产生在生物燃料微生物育种、生物工业中也有应用[35]，近年来，碳排放导致的人为气候变化，使生物柴油受到了全世界的广泛关注，重离子束可作为一种高效的诱变手段诱导高产生物燃料菌株，为清洁能源的工业化生产提供理论基础。Ma等[36]使用80 MeV/u 的12C6+离子束辐照微拟球藻，获得了一个生长速度较快的突变体HP-1。与野生型相比，HP-1的生物量积累和最大生长率分别提高了19%和6%，油脂产量提高了28%。王丽娟等[37]利用12C6+离子束对极大螺旋藻(Spirulinamaxima)进行辐照诱变，发现突变株的蛋白质和多糖含量均高于对照组。部分近年来重离子辐照诱导获得的高产工业菌株，见表1。

表1 重离子辐照在高产微生物工业菌育种中的应用

2 重离子辐照后突变菌株的筛选策略

重离子辐照诱变可以诱导大量突变体产生，但由于其非定向性造成筛选阶段工作量大。更具挑战性的问题是辐照后如何从海量突变体中快速将有应用价值的菌株筛选出来。传统筛选主要依靠人工分离纯化和摇瓶培养，通量低且速度慢。多孔U型底的微滴板(deep-square deep well microplate, MTP)与摇瓶有较高的相似性，可以替代摇瓶培养，提高培养效率[46-47]。现有的高通量筛选(High-Throughput Screening, HTS)方法，主要有四大类：①基于检测吸光度的筛选策略：直接检测目标分子结构或固有颜色[48]；间接检测，例如添加pH指示剂、金属离子螯合剂或通过酶促反应和化学反应，使不易直接检测的突变株可通过吸光度进行筛分。②基于检测荧光强度的筛选技术：直接检测目标产物的固有荧光信号；使用荧光染料、探针以及基于化学或酶联反应使目标菌株产生荧光信号进行筛分。③基于生物传感器的筛选策略:生物传感器通常分为基于蛋白质的生物传感器和基于核酸的生物传感器两种类型。大多数基于蛋白质的生物传感器都基于转录因子(TF)和工程荧光蛋白(FPs)，而基于核酸的生物传感器主要包括RNA核糖开关和RNA-荧光基团(RNA Spinach)以及基于结构转换的DNA生物传感器[49-50]。④基于特殊光谱的筛选策略：例如拉曼光谱(RS)[51]、傅立叶变换红外光谱(FTIR)[52]和傅立叶变换近红外光谱(FTNIR)等。

实际应用中一般会多策略联合或与流式细胞仪、微流体液滴系统结合[53]。微液滴可实现对单个真菌孢子的分选，一次筛选试验的试剂消耗可减少百万倍，降低了培育生产菌株的成本[54]。纳升级别液滴的微流体系统已成功应用到分离丝状真菌[55]、分泌维生素B2(核黄素)的乳球菌突变体[56]以及高产α-淀粉酶的酵母菌等。微流体液滴技术与荧光激活方法结合，也可显著提高菌株筛选效率[57]。

菌株不同生长状态和细胞类型可通过荧光强度和荧光类型识别。与目标菌株的细胞化学或物理特性相关的荧光信号使微生物可以通过荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)进行选择。理论上，每个突变体都可以通过荧光强度被检测和分类。由于FACS具有非特异性背景较高的缺点，因此通过FACS筛选的菌株需要微孔板培养进一步筛选。例如，Cao等[58]借助荧光激活细胞分选术筛选由常压室温等离子诱变(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)处理过的孢子，再将单个活孢子分选并喷雾到含有50 μL固体琼脂培养基的96孔板中，从5 760个突变体中获得了阿维菌素高产突变株，摇瓶和发酵培养的效价分别提高18.9%和20.6%。生物传感器和荧光激活细胞分选技术结合，也可以极大提高目标菌株的筛选效率。例如，Liu等[59]通过蛋白质组学分析得到的启动子构建了苏氨酸传感器，并利用荧光激活细胞分选技术从2 000万突变体库中筛选出400多株，进而分离到34个高产苏氨酸突变株。此外，流式细胞仪(Flow cytometer, FC)与细胞荧光染色技术结合后也可以实现对突变株的高通量筛选。Wang等[60]通过使用流式细胞仪检测单个细胞发出的荧光强度，筛选出了高产谷胱甘肽的酿酒酵母突变株。

3 重离子束诱导微生物突变的机制

重离子束诱导的遗传物质改变是获得稳定突变体的生物学基础[61]，本文将从辐照造成生物大分子损伤、DNA损伤以及损伤后遗传物质的修复路径三个方面阐明重离子束诱导生物体突变的机制。

3.1 重离子辐照造成微生物生理生化损伤

细胞膜是细胞与外界接触的第一道屏障，离子束可损伤或影响细胞膜的结构、流动性、通透性，影响细胞与环境之间的物质交换、能量转换和信号转导。α、β和γ粒子可沿轨道电离细胞组分，从而导致各种解离/电离通道，沿轨道的高能粒子会产生大量二次电子，继而对遗传物质和生物大分子造成更严重的损伤[62]。一般来说，电离辐射主要通过水的辐射分解[63]诱导自由基[64-65]形成，产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，损伤细胞膜、脂质和蛋白质[66]。Cao等[67]对模式生物酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞研究发现，辐照会使细胞膜完整性发生改变，导致细胞内蛋白质和核酸外泄，威胁细胞生存。对原核微生物耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)的研究发现，辐照会增加蛋白质的羰基化，阻碍蛋白质的催化活性[68]。细胞内大量参与生命活动的关键蛋白质受损，会严重影响正常生命活动的进行，例如碱基切除修复的DNA糖基酶，对辐照引起的DBS及时修复具有重要价值[69]，未修复或错误修复的DSBs会导致细胞遗传特性改变甚至凋亡。

3.2 重离子诱导微生物DNA突变的机制

DNA是遗传物质的基本单位，易受到内源性和外源性刺激损伤。内源性DNA损伤主要是由DNA与细胞内的水和ROS发生水解和氧化反应产生的，外源性刺激因子通常为紫外线、电离辐射以及化学诱变剂等[70]。重离子作为物理辐照源的一种，主要通过电离作用对生物大分子和细胞遗传物质造成损伤，从而改变微生物的遗传代谢特征。

原核微生物因为基因组相对较小，重离子束可直接作用于DNA使其电离，或由水辐射分解产生的分解产物(羟基自由基、过氧化氢、单态二氧)间接破坏DNA[71]。进入细胞的离子与生物大分子发生电离作用后会迅速沉积下来，电子直接附着在DNA主链上导致链断裂[72-73]。沉积的粒子还会引发生物细胞表面的二次粒子和电子溅射, 造成细胞膜表面穿孔，使后续粒子更容易进入细胞内部，最终导致 DNA 损伤和生物体变异[74]。

目前重离子辐照诱导微生物突变的机制大多是基于模式微生物酿酒酵母来探究的，酿酒酵母基因组大小约 12 Mbp，和高等真核生物具有高度的同源性，遗传背景清晰、基因功能研究深入[75-76]。在酿酒酵母中，线粒体是重要的细胞器，拥有独立于核DNA的基因组，能够编码与呼吸作用相关的关键蛋白质[77]，确保呼吸作用为真核细胞提供能量[78]。新一代测序技术的出现，促进了功能基因组学和分子育种的研究，目前全基因组序列比对[79]可揭示重离子如何改变遗传物质。Guo等[80]通过对比碳离子束(carbon ion beam, CIB)照射后酿酒酵母的全基因组序列差异发现在核基因组中，CIB的照射主要引起碱基的置换和一些小的DNA插入/缺失。Szumiel[81]研究发现，在酿酒酵母中线粒体DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)是辐射损伤的主要靶点之一，而mt DNA的损伤会严重影响细胞的生理代谢甚至导致细胞凋亡[36,82]。高LET的重离子束造成酿酒酵母核DNA损伤的一个显著特征是突变位点集中在核小体之间的连接区附近[83]，而伽玛射线引起的突变分布均匀；突变谱分析表明，碳离子束和γ射线均能显著诱导G∶C到T∶A的转换[84]。

3.3 突变DNA的修复机制

目前，针对重离子诱导的微生物遗传物质损伤修复机制研究较少，在酵母中，同源重组(homologous recombination, HR)通路在DSBs修复中占主导地位[84]。可以做为高等真核细胞中对损伤修复机制研究的参考。细胞主要通过HR[85]和非同源末端连接(classical nonhomologous end joining, C-NHEJ)[86-87]来修复DSBs(图1)。复杂的DSBs可以有效地激活DNA末端切除，因此，大约85%的复杂DSBs在DNA修复过程中被切除[88]。尽管在不同类型的细胞中C-NHEJ和HR通路的使用频率有差异，但研究表明C-NHEJ在整个细胞周期中均起作用，而HR在DNA复制后的S(S phase)/G2(G2 phase)期相对活跃[89]。C-NHEJ主要通过多种修复蛋白的协同作用连接DSBs的末端，尽管C-NHEJ具有较高的出错率，但其可快速抑制染色体易位，对保护基因组的完整性具有重要价值。Yajima等[88]在宫颈癌细胞(HeLa细胞)中发现，与X射线或激光辐照相比，高LET重离子辐照诱导的DSBs优先由HR修复。HR通常需要以同源序列作为模板，精确地重建损伤丢失的序列。Lee等[90]使用重离子束照射同一供体的淋巴细胞，在G2期细胞中观察到了染色体畸变增加，这表明一些DSBs可能通过易出错的途径修复，如替代性末端连接(alternative end joining, A-EJ)和单链退火(single-strand annealing, SSA)[91-93]。

图1 两种主要的DSBs修复途径(修改自文献[90]、[94])

在人G2期细胞中，约70%的DSBs由C-NHEJ修复，30%的DSBs由HR修复。C-NHEJ 从Ku蛋白与DNA断裂端结合开始，DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunits, DNA-PKcs)经过磷酸化与Ku蛋白组成DNA-PK(DNA 依赖性蛋白激酶)，促进DNA连接酶和X 射线修复交叉互补基因4(XRCC4)、XRCC4类似因子(XRCC4-like factor, XLF)等聚集到断端形成连接复合体[94]。随后，经过多种修复蛋白因子对DNA末端的加工修饰作用，完成DSBs修复。HR过程起始于MRN复合体(MRE11/Rad50/NBS1 complex)对DNA断端的识别结合，同时还与招募的BRCA1/2和CtIP(CtBP-interacting protein)等，对断端进行加工。CtIP随后募集复制蛋白A(replication protein A, RPA)至加工过的单链上，稳定断端DNA并激活ATM与Rad3相关蛋白激酶(ATM-and Rad3-related protein kinase, ATR)，促进DNA链侵入。HR的关键步骤是Rad51竞争替换 RPA，形成核蛋白细丝，促进与姐妹染色单体的重组，完成DNA链配对、延伸之后HR修复过程结束[89,93]。

4 展 望

本文简要综述了重离子辐射的生物效应，辐照后突变株的筛选方法以及近年来通过重离子辐照技术选育的一些高产菌株。但目前重离子辐照诱变技术在筛选微生物突变株方面还存在一些问题。①重离子技术对设备要求较高，使其发展受限。世界范围内仅有几家重离子加速器装置，主要分布在中国(中国科学院近代物理研究所)、日本(NIRS、RIKEN)、德国(GSI)、美国(LBL)、法国(GANIL)、意大利(LNS)等。②不同离子束和辐照剂量对菌株的诱变效果存在差异。重离子有多种类型，例如16O6+、12C6+、20Ne10+、36Ar18+、40Ca12+、129Xe27+等。目前，12C6+离子束主要被用于微生物育种和植物育种，后续的研究也可探究不同辐照源对菌株诱变效果的差异并总结规律，以期提升诱变效率。③突变基因在稳定遗传性方面存在的问题。在针对拟南芥的研究中发现，大多数严重的DNA损伤，包括由辐射引起的大量缺失(从kb到Mb)，不能遗传给后代。这是由于一般子代只能稳定遗传1～4 bp缺失突变[83]，大片段的缺失可能涉及到对配子发育或生存能力至关重要的基因。因此重离子辐照育种是否具有遗传稳定性，还需要更多的实验验证。

尽管重离子诱变在微生物育种方面已经取得了一些成功，但目前对重离子诱变的阳性突变株代谢物积累的生理机制认识有限，随着组学技术的发展，未来可结合多种工具对重离子诱变的机制进一步研究。在解析机理的基础上，将重离子束的高效诱变育种与生物工程技术融合，定向培育高产微生物菌株，快速提高微生物代谢产物的产量，使其更好地服务于生产生活。